2010生物显微技术论文—— 半薄切片法

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1、生物显微技术课程论文（2010——2011学年，第一学期）半薄切片法摘要：半薄切片(厚度为0.5μm～1μm)的制备是一种常用制样手段。半薄切片图像的清晰度、分辨率远优于石蜡切片，视野大于超薄切片，有利于获得高质量的光镜图像，同时也是电镜超薄切片技术中一种有效的定位方法。其中的一些关键技术如固定，切片，染色等也不同于石蜡切片和超薄切片，有其特点和难点。关键词：半薄切片切片染色旋转薄切片机一、半薄切片法内容简介（一）、概念：一般使用玻璃刀在超薄切片机上切出厚度为0.5μm～1μm的切片，界于5微米石蜡切片与600埃超薄切片之间，半薄切片在高倍光镜下可显示电子显微镜的低倍图像，是切片技术中很有

2、用的一种定位方法。（二）、半薄切片样品制备步骤：取材固定漂洗脱水渗透包埋半薄切片切片染色包括以上几个步骤。其中的一些关键技术如切片，捞片，脱脂，染色等也不同于石蜡切片和超薄切片，有其特点和难点。1、固定——制备半薄切片使用的固定液：①FAA固定液制备：福尔马林5-冰醋酸5-70%酒精90应用：半薄/石蜡切片适用：一般固定根、茎、叶、花药、子房组织切片。补充说明：幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，防止材料收缩；加入5%甘油可防固定液蒸发和材料变硬②卡诺固定液制备：渗透迅速，固定根尖和花药只需30-60分钟，但固定时间不能太久，一般不超过一天1、切片染色——半薄切片的染色法：半薄切片的染色常

3、规方法有：甲苯胺兰染色法、天青Ⅱ美兰染色法、碱性复红法、苏木素-伊红法、H．E染色法和Giemsa染色法等。无论哪种方法都需预先做处脱树脂理，否则染料不宜渗入，影响染色效果。脱树脂处理，其过程是将干燥切片插入氢氧化钾无水酒精饱和溶液l0～15min后，无水酒精洗三次，经梯度酒精下行，水洗后染色。此过程即繁琐又费时，所以选择理想的染色剂非常重要。①几种染色方法及现象②染料介绍：染色原则：先用碱性染料染再用酸性染料染。③各种染色剂的特点常规的甲苯胺兰染色液是以磷酸缓冲液(pH7．2)为溶剂呈弱碱性，而硼砂(Na：B0·10H20)水溶液呈强碱性pH9．3。通过以其代替磷酸缓冲液配制的甲苯胺兰染

4、色液，大大提高了组织细胞的着色力。比较改良前后的两种甲苯胺兰染色液，改良后的染色液不仅不需脱树脂等繁琐步骤而省时，组织细胞的结构更清晰。美蓝-天青Ⅱ法、碱性复红法、苏木素-伊红法染出的颜色单一,或者程序较多、所需时间长。Chien法虽无上述缺点,但染片容易出现过染,常呈现一片红色,分色也不易控制。④制片染色过程中的注意事项半薄切片的制片程序中每一步骤要求都十分严格。因为，切片的反差清晰度很大程度上取决于染色的质量，所以切片的染色技术是做好半薄切片的关键环节。国内报导的半薄切片厚度在O．5—2微米之间，当厚度小子0.5微米时，切片组织不易着色或出现染色不均，而厚度达到0．1微米，染色后出现大

5、量皱褶，直接影响观察效果，成为半薄切片技术的一个难以解决的问题。（三）、半薄切片进行光学显微镜观察的目的：①可以根据半薄切片精确定位。对于超薄切片来说，包埋块中的组织面积还嫌大，还需要修小，如果盲目地修小，就有可能把要观察的部分修掉，因此要切厚片用光学显微观察，以便准确定位，保留要用电镜观察的部分，修去其余部分，避免丢失有价值的结构；②了解样品包埋质量，以确定是否继续做超薄切片；③半薄切片可以得到比一般石蜡切片更清晰的图像，所以便于进行定量形态学分析，而且可与超薄切片对照观察研究。④便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察。半薄切片定位以后，要对包埋块作进一步的修整。通常将块

6、的顶端修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形(最好是梯形)，每边的长度不超过0.2mm～0.3mm为宜。（四）、半薄切片法的应用：半薄切片，被应用于各个方面，如，胚胎学，病理学，等等。目前，国外这项技术已应用于植物细胞学研究，国内医学中也已得到应用，是一种普遍的切片方式。（五）、半薄切片的优点：半薄切片（厚度为0.5μm～1μm）的制备，在如今是一种常用制样手段。采用这种方法克服了超薄切片的盲目性和电镜视野的局限性．有利于在电镜下能较大视野研究细胞之间的正常和病理关系。同时半薄切片图像的清晰度、分辨率远优于石蜡切片，视野也大于超薄切片，所以有利于获得高质量的光镜图像。同时，半薄切片，也是电镜超

7、薄切片技术中一种有效的定位方法。二、使用旋转切片机制作半薄切片：（一）、LeicaRM2265旋转薄切片机简介：1、仪器特点LeicaRM2265是机动的旋转切片机。其主要特点有：①适用于系统的样本是不后退并且不需要维护的交叉滚筒引导；②仪器装配有带手柄的安全手轮，该手轮可以被居中，也可以进行机械锁定；③所有控制和LED都集中在一个独立的控制面板上。所有的控制成分都合理定位于相应的功能组，可轻易识别；④样本回收程序可以被