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1、18第8讲半薄/超薄切片技术取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块→切片→染色背景：肉眼光学显微镜透射电镜分辨率0.2mm0.2µm0.2nm应用范围可观察头发丝、双面刀刀刃的厚度可观察细胞的结构(最大有效倍数:1000)可观察细胞内的结构,分辨DNA、蛋白质等生物大分子、单个金属原子（放大倍数可达百万倍）观察半薄切片观察超薄切片n现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类：一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法；另一类是生物制品特殊技术，包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、电镜细胞化学术、免疫电镜术、电镜放射自显影技术、X线微区分析技术等。基本概念一、生物样
2、品制备技术的重要性1、决定电镜图像分辨率的两个因素1）电镜本身的分辨本领2）样品的结构和反差，而样品的结构与反差在很大程度取决于样品制备技术2、电镜样品应具备的基本条件1）样品必须彻底干燥；2）样品要进行提高反差处理2）样品要进行提高反差处理4）样品耐受电子束的轰击5）充分保存好生物样品的超微结构二、TEM样品制备技术分类1、超薄切片技术（普通）2、冷冻超薄切片技术3、冷冻置换和低温包埋技术4、金属投影技术5、表面复型技术6、冷冻(断裂)蚀刻及复型技术7、免疫电镜技术8、电镜细胞化学技术7、8、9是TEM，SEM共有9、电镜放射自显影技术三、超薄切片技术概述181
3、、超薄切片★样品厚度在10～100nm之间的切片，超薄切片TEM专用石蜡切片h=10mm(5~50mm)2、制作超薄切片的必要性1)增加电子透射能力2)电镜的场深大，切片太厚，上下结构重叠,使得图像不清楚3)减少色差4)减少样品对电子的吸收3、对超薄切片的要求⑴细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应⑵切片厚度500～700Å为宜,小于1000Å太薄：d高，反差低太厚：d低，反差好，结构重叠，电子甚至不能穿透⑶切片应耐电子束的强烈照射，不变形，升华⑷切片能够适当被染色，保证一定的反差⑸切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他化学物质的沉淀普通
4、超薄切片技术：一、取材二、固定三、脱水四、渗透与包埋五、超薄切片六、电子染色一、取材1、含义：指从生物体上取下要观察的组织块。注意：由于水解酶的作用可引起细胞自溶2、取材操作规则:快,小,冷,准,稳,轻(防损伤)⑴快：动作迅速,快取,投入固定液⑵小：样品体积小,动1mm3,植宽1，长3～4mm⑶冷：0～4℃⑷准：取的部位准，有代表性、目的性⑸轻：操作轻巧，避免拉、锯、压A、按样品类别分为：⑴动物材料麻醉→解剖→戊二醛预固定（0～4℃，2％～5％）在预冷的玻板上细切（1mm3）→戊二醛前固定(1～3h)→漂洗（10～30min）→1％锇酸后固定(1～2h)⑵植物材料
5、叶片宽1，长3～4，有时需脱蜡根茎果实1mm3⑶单细胞：洗去有机成分→固定→预包埋→切块B、按取材地点分为：⑴野外取材：冰壶⑵实验室室内取材1.2取材方法18材料放在洁净的韧性较大的纸上→滴上预冷的固定液→用刀片将组织切下并修小→用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。二、固定（一）固定的基本知识1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来.2、常用的固定方法n化学方法：锇酸（OsO4),戊二醛（C
6、5H8O2),甲醛(HCHO)，高锰酸钾KMnO4、重铬酸钾、丙烯醛n物理方法：冷冻，干燥，高温3、固定的目的⑴把细胞中的动态系统定格，要求生命过程立即停止,细胞和它周围组织中的半液体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有机体的生活状态⑵防止以后的制备过程中丢失或添加成分⑶使其在电镜下有良好的电子反差4、固定的标准细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集5、固定液的作用：1）组成：固定液：固定剂＋缓冲液2）作用：⑴破坏细胞的酶活性系统⑵稳定细胞物质成分，并保存之⑶接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀⑷在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞
7、器的空间构型18⑸提供一定的电子反差（二）常用的固定剂1、常用、理想固定剂应具备的条件1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化2）稳定细胞成分和结构，使各种结构成分凝固或变性，以保证后续的各种处理中物质不溶解、不丢失3）使细胞不变形，保持各种结构生活时形状，不产生人工假象，以保证电镜图像的真实性。4)能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定5)最好提供一定的反差,并有防腐作用2、理想固定剂1）锇酸（OsO4)优点：⑴几乎和细胞内所有成分发生化学结合⑵对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作用良好⑶可保存脂肪,形成脂
8、肪-锇复合
