百合主要病毒的分子检测及脱毒技术研究

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1、摘要百合是一种集观赏、食用、药用价值于一身的重要经济作物。近年来，病毒病的发生导致百合切花及种球品质严重下降，制约了百合生产的发展。因此，建立快速、准确的百合病毒检测体系和有效的脱毒体系是减少病毒对百合的危害、恢复种性的关键问题之一。本研究选取对危害百合危害最严重的黄瓜花叶病毒(CMv)、百合无症病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)作为研究对象，基于病毒外壳蛋白(CP)核酸序列设计引物，建立了三重RT-PCR病毒检测体系；克隆了北京百合样品的三种病毒CP基因全序列，并应用该体系对部分百合栽培品种、组培苗及野生种的病毒发生情况进行了调查；对感染病毒的铁炮系‘雪皇后’品

2、种进行了系统的脱毒研究。主要研究结果如下：根据基因库中CMV、LMoV、LSV的CP基因序列，设计了3对特异引物，通过对扩增条件的优化，可从带有CMV、LMoV和LSV的样品中同时扩增出3条与试验设计大小相符的657bp(CMV)、428bp(LMoV)、171bp(LSV)的特异条带。通过同源关系鉴定可知：本研究所获得的3种病毒CP基因与GenBank中登录的其它分离物核苷酸同源性在90％以上，地域差异不显著，外壳蛋白序列高度保守。针对3种病毒的CP全序列设计引物，分别进行R1：PCR扩增，获得铁炮百合‘雪皇后’品种的3种病毒外壳蛋白基因全序列。片断大小分别为CMV(

3、657bp)，LMoV(825bp)，LSV(844bp)。通过NCBI的Submission程序在GenBank上登录，获得序列号EFl58108，EFl58109，EFl58110。应用已建立的多重RT-PCR方法，对百合田间栽培品种、组培苗和野生群体进行病毒检测。结果表明：抽检的9个田间栽培品种均受LMoV和LSV复合侵染，病毒在同一栽培区域内相互传播，使该栽培区域的百合全部感染病毒。抽检的8个组培苗品种中，3个样品LSV呈阳性，证明该方法可以用于脱毒组培苗的病毒检测。对岷江百合(Liliumregale)7个群体的检测结果表明：采自四』lf茂县石大关乡的样品，L

4、SV呈阳性。这是国内首次报道在野生种的岷江百合中检测到该病毒。通过核萤酸同源性分析可知，该岷江百合CP基因序列与其它分离物同源性很高，达到98．5％．99％。采用茎尖培养与病毒唑相结合的方法，设计茎尖大小与病毒唑浓度的不同组合，最终确定病毒唑浓度4mg／L，茎尖大小在0．5．0．7mm范围内为最优。该组合能保证较高的成活率和脱毒率，且操作简便，茎尖生长周期短，成苗快。最后本研究初步探索了由鳞片扦插获得不定芽结合病毒唑的脱毒途径。结果表明，通过该方法可以获得脱毒苗，但脱毒效果不理想，有待于进一步完善。关键词：百合；病毒检测；多重RT-PCR；脱毒MolecularDete

5、ctionandEliminationTechniqueofLilyVirusesAbstractLiliumspp．isanimportanteconomiccropwithornamental，edibleandofficinalvalue．Virusdiseasesaffectthequalityofthecutflowersandbulbsoflilywhichlimitedthedevelopmentoflilyproduction．Howtoestablishasystemofrapidandsensitivedetectionandusefulvirus—

6、freetechniqueisthekeyquestioninreducingtheharmtolilyproductionandrecoverthequalityofspecies．Inthisstud弘threeviruseswhichdogreatestharmtoliliesarechosen．Theyare：Cucumbermosaicvirus(CMV),Lilysymptomlessvirus(LSV)andLilymosettlevirus(LMoV)，AmultiplexRT．PCRdetectionsystemhasbeenestablishedac

7、cordingtotheanalysisofcoatproteinsequencesoftheseviruses．ThewholesequencesofthevirusCPgeneinBeijingsampleshavebeenclonedanddetermined，ThedetectiontechniquewaSusedtodetectoccurrenceofthethreevirusesinlilyofcultivars，tissuecultureandwildgroup．Alsowedidexploratoryresearchont