广州管圆线虫病防治的相关基础研究及钩端螺旋体病DNA疫苗的研究

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1、中山大学博士学位论文广州管圆线虫病防治的相关基础研究及钩端螺旋体病DNA疫苗的研究广州管圆线虫病防治的相关基础研究及钩端螺旋体病DNA疫苗研究专业：病原生物学博士生：何汉江指导教师：吴忠道教授摘要第一部分广州管圆线虫病防治的相关基础研究广州管圆线虫病是一种自然疫源性疾病，其病原体为广州管圆线虫[Angiostrongyluscantonensis(Chen，1935)Dougherty,1946]，该病已被卫生部列为新发传染病之～。人为该虫的非适宜宿主，常因生食、半生食含有III期活幼虫的淡水螺肉而感染。幼虫侵入人体后主要移行到中枢神经系统，引起以嗜酸粒细胞浸润为主的中枢神经系统炎

2、症反应，造成对神经元的损伤，其病变多累及大脑、小脑、脑干、脊髓等，脑脊液中嗜酸粒细胞增高明显，故称为嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎。感染严重时致患者死亡或留下后遗症。我国台湾、广东、广西、云南、福建、浙江、海南、湖南及江西先后报道发现该病的自然疫源地。近年来，浙江、福建、云南及北京先后出现该病的群体爆发事件。广州管圆线虫病的扩散与流行是我国公共卫生面临的新问题。由于中间宿主福寿螺及褐云玛瑙螺的大量养殖与食用，加上气候变暖，导致该病的向北扩散，防治难度加大。该病发生与饮食习惯有关，常发生爆发事件，且感染后主要造成中枢神经系统的损伤，危害严重。目前对该病的研究尚不系统和深入，为此有必要进一

3、步加强相关基础研究工作，为关键防治技术的研制应用提供理论支撑和新思路。中山大学博士学位论文广州管圆线虫病防治的相关基础研究及钩端螺旋体病DNA疫苗的研究自陈心陶教授于1933年发现广州管圆线虫后，相关基础研究仍较薄弱。例如尚未见到广州管圆线虫种群研究或者遗传多态性的报道，无法深入了解其种群的遗传变异信息及其生物学特性。脑脊液中嗜酸粒细胞增高是该病的特征。已有研究提示嗜酸粒细胞存在活化现象，但缺乏其存在活化现象的直接证据一活性产物的检测。嗜酸粒细胞活性产物女NECP具有较强的细胞毒性，嗜酸粒细胞活性产物可能为该病的致病因素。嗜酸粒细胞活化因子除IL5已见报道之外，其它活化因子!ZNC

4、5a及LTB4尚未见报道。C5a及LTB4同时也是重要的炎症因子。因此有必要进一步开展嗜酸粒细胞活性产物及活化因子的研究，有助于迸一步了解该病的发病机制。如何预防虫体杀死后其虫体组分在脑部引起的超敏反应是广州管圆线虫病治疗过程中需要解决的问题，目前有采用抗寄生虫药物与激素类药物联合用药的方案，但激素类药物存在许多副作用(诱发精神神经症状)，寻找替代药物是目前的研究热点。本课题在国家“863”项目基金的资助下，开展了广州管圆线虫遗传多态性及其对不同宿主的易感性研究，感染小鼠嗜酸粒细胞活化相关因子的检测，阿苯达唑联合黄芩素对广州管圆线虫病治疗效果的实验研究。第1章广州管圆线虫的生物学特

5、性研究研究目的分析来源于不同地理环境的广州管园线虫株的C01和ITS2基因以及PCR．ISSR的多态性，了解广州管圆线虫的遗传多态性。比较广州管圆线虫广州株在中间宿主褐云玛瑙螺和福寿螺螺体内的发育情况及对非适宜宿主BALB／c小鼠和昆明小鼠的毒力，为建立实验室广州管圆线虫生态系统和实验动物模型提供依据。研究方法从海口、南宁、广卅l、福州及温州采集褐云玛瑙螺或福寿螺，从中分离幼虫感染鼠类后收集虫体或直接从家鼠中分离成虫。采用PCR扩增COl及ITS2的DNA片段，T-A克隆后测序，序列对齐分析、构建遗传树，并进行SSCP分析。同时进行PCR．ISSR扩增，产物通过琼脂糖电泳直接进行分

6、析不同地区来源的广州管圆线虫是否存在基Ⅱ中山大学博士学位论文广州管圆线虫病防治的相关基础研究及钩端螺旋体病DNA疫苗的研究因多态性。同时，连续7d分别用感染大鼠的粪便喂食实验室传代的福寿螺和褐云玛瑙螺，1个月后解剖感染螺，观察螺体内广州管圆线虫幼虫的发育及虫数；从褐云玛瑙螺和福寿螺分离广州管圆线虫Ⅲ期幼虫(L3)分别感染昆明鼠；而感染BALB／c小鼠的III期幼虫来自于褐云玛瑙螺。通过观察感染小鼠的死亡率、体重变化、MMP．9活性、脑组织的病理变化、脑内虫体数及脑脊液总蛋白含量等指标评价不同宿主来源幼虫的致病力。结果与分析来自同一地区的广州管园线虫虫株C01及ITS2序列一致，PC

7、R．ISSR条带相同。广州、南宁及福州来源的虫株ITS2序列一致。温州虫株ITS2与前三者相差2个碱基，遗传距离为0．00791。海口虫株与广州株相差1个碱基，遗传距离为0．00395。中国大陆虫株与菲律宾虫株相比相差l～2个碱基，遗传距离为0．00797及0．00396。中国大陆虫株与日本虫株相比相差3～6个碱基，遗传距离最远。用系统发育的方法分析可将其分为5支：广州、南宁及福州来源的虫株为1支，海口来源虫株为1支，温州来源的虫株为1支，菲律宾虫株为1支，日本虫株为