中华稻蝗几丁质酶基因10(OcCht10)的分子特性及功能

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1、中国农业科学2014,47(7):1313-1320ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.008中华稻蝗几丁质酶基因10（OcCht10）的分子特性及功能111121李大琪，王燕，张建琴，李涛，孙毅，张建珍12（山西大学应用生物学研究所，太原030006；山西省农业科学院生物技术研究中心，太原030031）摘要：【目的】获得中华稻蝗（Oxyachinensis）几丁质酶基因10（OcCht10）的cDNA序列，预测其功能域，并做聚类分析明确该基因的系统发育关系。绘制OcCht10在5

2、龄若虫不同组织部位和发育时间的表达图谱，研究其在中华稻蝗蜕皮过程中的生物学功能，为害虫防治提供高效安全的候选基因。【方法】从中华稻蝗转录组数据库搜索OcCht10cDNA片段，经过blast分析、比对、拼接后，翻译为氨基酸序列，预测其功能域，并与其他昆虫几丁质酶家族基因进行聚类分析，进一步确认该基因的系统发育关系并进行准确命名；选取中华稻蝗5龄第6天不同组织部位及5龄若虫不同天数表皮样本，总RNA提取后反转录为cDNA模板，采用Real-timequantitativePCR（qPCR）方法获得OcCht10在5龄稻蝗若虫不同组织部位和不同发育阶段的表达谱；设计OcC

3、ht10dsRNA引物，用试剂盒体外合成dsOcCht10，采用注射法进行RNA干扰；取注射24h稻蝗表皮样本，用qPCR方法检测OcCht10基因沉默效率；并仔细观察dsRNA注射后稻蝗表型，统计其死亡率。【结果】经对中华稻蝗转录组数据库的搜索，获得OcCht10cDNA片段长度为9318bp，开放阅读框为8613bp，编码2870个氨基酸；其3′非编码区为705bp，推测OcCht105'端有500多碱基尚未获得；预测其氨基酸序列具有多个结构域，包含有5个几丁质酶催化域和6个几丁质结合域；与其他昆虫几丁质酶基因聚类分析结果显示OcCht10属于昆虫几丁质酶家族基因

4、Ⅱ组，该组基因与昆虫蜕皮相关；5龄若虫组织特异性分析表明该基因主要在表皮、前肠和后肠等外胚层发育而成的组织器官中表达，提示OcCht10可能参与表皮几丁质代谢；发育时间表达图谱表明该基因在5龄第6—7天，即蜕皮前的表皮中高表达，表明OcCht10可能负责蜕皮时表皮几丁质降解；5龄若虫第2天注射该基因的dsRNA，24h后取表皮检测其干扰效率，结果显示该基因被沉默70%；与注射dsGFP的对照组相比，注射dsOcCht105龄若虫表现为龄期延长，旧表皮无法开裂，蜕皮受阻，昆虫无法正常活动导致死亡，死亡率达到100%。【结论】获得OcCht10的部分cDNA序列，该基因在

5、昆虫蜕皮前表皮中高表达；OcCht10参与中华稻蝗的蜕皮发育，注射dsOcCht10可有效沉默靶基因，并导致试虫无法完成正常蜕皮而死亡。关键词：中华稻蝗；几丁质酶基因；实时定量PCR；RNA干扰MolecularCharacterizationandFunctionofChitinase10Gene(OcCht10)fromOxyachinensis111121LIDa-qi,WANGYan,ZHANGJian-qin,LITao,SUNYi,ZHANGJian-zhen12(ResearchInstituteofAppliedBiology,ShanxiUniver

6、sity,Taiyuan030006;BiotechnologyResearchCenter,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan030031)Abstract:【Objective】TheobjectivesofthisstudyaretoobtaincDNAsequenceofchitinase10gene(OcCht10)fromOxyachinensis,analyzeitsfunctionaldomainandphylogeneticrelationshipwithchitinasesfromotherkno

7、wninsectspecies,investigateitsexpressionpatternsandbiologicalfunctionduringmoltingprocess,andtoprovideanewcandidategeneforpestcontrol.【Method】收稿日期：2013-10-24；接受日期：2013-11-05基金项目：国家自然科学基金项目（31272380，31201710）、教育部博士点专项基金（博导类）（20121401110008）、教育部留学回国人员科研启动基金（20111139）、山西省高等学校优秀青年学