体外翻译系统在分子生物学研究中的应用

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1、万方数据·18·垦盐堕兰塑士生塑了分册2052印璺!!墨兰—L塑体外翻译系统在分子生物学研究中的应用李前综述孙曼霁审阅Q1A军事医学科学院毒物药物研究所(北京．100850)摘要体外翻译系统卫称无细胞蛋白质合成系统，是分子生物学中一种常规的表达系统。该系统可用于蛋白质快速分析鉴定．基因转录和翻译的调控机理的研究“及分子问的相互作用的研究，如蛋白质和蛋白质的相互作用，蛋白质与DNA的相互作用，蛋白质与RNA的相互作用等。关链词体外翻译系统；基因表达调控体外翻译系统叉称无细胞蛋白质合成系统，是一种相对胞内表

2、达系统而言的开放表达体系。翻译系统内的组分和翻译条件可以根据需要进行适当的改变，因而体外翻译系统中翻译特定的基因较胞内表达系统具有许多优点如内源性mRNA干扰很小(由于体外翻译系统是用指定的模板进行目的蛋白质合成，因而可以大大降低或消除在体内翻译系统中由于内源mRNA所造成的背景)；可以同时加人多种基因模板研究多种蛋白质的相互作用；体外翻译系统可以对基因产物进行特异性标记，便于在反应混合物中检测。此外体外翻译系统是一种蛋白质快速鉴定系统，蛋白质表达可以不需要先进行克隆。目前．体外翻泽系统有兔网织红细胞系

3、统、麦胚提取物系统、￡．coli$30系统3种。1真核体外翻译系统在分子生物学研究中的应用1．1兔网织红细胞系统体外翻译系统中兔网织红细胞系统是真核体外翻译系统中应用最广泛的一种，常用于较大的mR—NA种类鉴定．基因产物性质的分析，转录和翻泽调控的研究，以及共翻译加工的研究等等。兔网织红细胞用新西兰大白兔制备“j，通过纯化除去兔网织红细胞以外的污染细胞。网织红细胞裂解后，提取物用微球菌核酸酶破坏内源mRNA，最大限度降低翻译背景。裂解物包含蛋白质合成所必须的细胞内组分(tRNA，核糖体，氨基酸，起始、延

4、伸、终止因子)。为了使系统更适于mRNA的翻译，兔网织红细胞中还添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统，以及氯化高铁血红索防止翻译起始的抑制，此外还添加了tRNAs混合切用于扩大mRNA翻详的范围，以及乙酸钾和乙酸镁等。兔网织红细胞具有一定的翻译后加工活性，包括翻译产物的己酰化，异戊二烯化，蛋白酶水解和一些磷酸化活性。信号肽切除以及蛋白质糖基化等翻译后加工事件町以通过加入犬微粒体膜来实现o]。1．2．1利用兔网织红细胞体外翻译系统进行蛋白质表达鉴定兔网织红细胞体外翻译系统对外源基因进行表达具有简单、

5、快速的优点，常被应用于对所构建的基因进行快速鉴定，通过SDSPAGE检测翻译后蛋白质分子量的大小以证实基因的读码框架是否正确，以及基因表达的蛋白质是否存在错义突变．大小是否完整，或通过测定表达产物的活性进行鉴定口“一。PCR技术结合体外转录和翻译系统可以使基因不需要先克隆而直接进行表达“一。许多基因疾病和肿瘤都是突变的结果，如终止密码子突变．移码或基因片段缺失，一般都导致截断的基因产物。一般需通过测序来鉴定是否突变，这是最可靠的检测方法。但要对许多样品筛选．测序工作量则太大。在l993年，Roesl等发

6、展了一种蛋白质截断试验．在体外翻译系统中快速而简单地对这些截断的突变体进行筛选“o。1．2．2研究影响蛋白质翻译过程和翻译后加工的因素利用体外翻译系统的开放特性可以在翻译前，翻译过程中，以及翻译后添加各种蛋白质、核酸、药物、无机离子等(如在体外翻译后加人蛋白酶，研究产物的抗蛋白酶水解作用“，或加人适当的离子，研究产物的活性与离子的关系”1)．或是改变反应的温度、时间等翻译过程中的影响因素．以研究表达产物的性质⋯。翻译系统还常用于进行蛋白质的翻译后加工的研究．如信号肽的切除和产物的糖基化加工等o⋯。在体外

7、翻译体系中加人犬微粒体膜，表达产物可进行糖基化加工，不加膜产物不被精基化，糖基化产物通过SDS—PAGE可区别于未糖蓬化的蛋白质。“。1．2．3利用兔网织红细胞体外翻译系统研究分子问万方数据璺墅匿兰坌±生塑兰佥盟：!丝!一塑塾鲞曼!塑相互作用体外翻译系统{E研究分子间相互作用的领域中的应用日益广泛，包括蛋白质和蛋白质的相互作用，蛋白质与I)NA的相互作用，蛋白质与RNA的相互作用，甚至RNA与RNA的相互作用也可利用体外翻译系统进行研究。如反义核酸包括反义寡聚桉苷酸[1“、肽核酸““、反义硫代磷酸寡脱氧

8、核苷酸““等对mRNA转录的调控研究。真核细胞翻译起始的效率与翻译起始因子以及核酸序列元件相关．5’非翻译区序列．操纵于结构，以及起始密码子附近的序列都有很大的影响。通过体外合成5’端含不同序列元件的核酸FF列，在体外系统中翻译．可以直接检测序列与翻译效率的相应关系““。转录翻译调控园子与DNA或RNA的相互作用，可通过电泳迁移率变动分析(EMSA)，研究它们之间的相互关系．这在研究转录和翻泽的调控中应用较多，如各种蛋白质／肽的顺式或反式凋