心肌肌钙蛋白基因突变与肥厚型心肌病发病研究

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1、南京医科大学博士学位论文心肌肌钙蛋白基因突变与肥厚型心肌病发病研究姓名：万文辉申请学位级别：博士专业：内科学（心血管）指导教师：张寄南;马文珠2003.4.1缩略语(1)缩略语(2)符号与缩写英文名称文名称A或A1aA1anine丙氨酸R或ArgArgillinc精氨酸N或AsnAsparagine天冬酰胺D或AspAsparticacid天冬氨酸C或CysCySteine半胱氨酸!Q或GinGlIItamine谷氨酰胺E或G1UG1lltamiCacid谷氨酸G或GlyG1vcine甘氨酸H或HiSHiStidine组氨酸I或IleIS0leUCine异亮氨酸。L或L

2、euLeucine亮氨酸K或LysLysine赖氨酸M或MetMethionine蛋氨酸F或PhePhenylalanine苯丙氨酸P或ProProline脯氨酸S或SerSerine丝氨酸T或ThrThreonine苏氨酸W或TrpTryptophan色氨酸Y或TyrTyrosine酪氨酸V或valValitie缬氨酸4心肌肌钙蛋白基因突变与肥厚型心肌病发病研究论文摘要背景：肥厚型心肌病是一种原发性的·CA,‘IL病，以·CA室肥厚和肌纤维排列紊乱为特点。家族性肥厚型心肌病以常染色体显性方式遗传。国外报告患病率约为0．20A。江苏省人民医院心血管流行病研究室在1985

3、—1994年间对60岁以下人群进行研究，报告年平均发病率为1．3-1．5／10万。患者I临床表现变异较大，可无症状亦可出现严重心律失常、心力衰竭甚至猝死。肥厚型心肌病是健康个体最主要的猝死原因之一。研究肥厚型心肌病病因，发病机制具有重要的临床意义：1．可以更好的定义和诊断该疾病；2．增加对该病病理生理的／．k／f,；3．对该病和左心室肥厚(LVH)分子基础的阐明起关键作用；4．可以在出现临床症状前得到诊断及遗传咨询；5．对患者进行危险度分层：6．为探讨新的治疗方法提供理论依据，防止该病在儿童时期的进展或促使该病在成年／,．oe消退。目前已知至少有11种编码肌小节蛋白的基

4、因约近200种突变与肥厚型心肌病有关，即：B一肌球蛋白重链(13-myosinheavychain，]B-MyHC)、·CA肌肌钙蛋白T(cardiactroponiIIT，cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cardiactroponinI，cTnI)、心肌肌钙蛋白C(cardiactroponinC，cTnC)、肌球蛋白结合蛋白c(myosinbindingproteinC，MyBP—C)、肌联蛋白(titin)、肌球蛋白幽需轻链和调节轻链(myosiIIesselltialandregulatorylightchains)、cc一肌动蛋白(alpha-actin)、仅一原

5、肌球蛋白(alpha-tropomyosin，c【-TM)、O【一肌球蛋白重链(alpha—myosinheavychain，o【一MyHC)。其中约15-20％的肥厚型心肌病患者由心肌肌钙蛋白I、T基因突变引起。目前肥厚型心肌病的病因研究进展很快，但对发病机制的研究相对滞后。目的：研究肥厚型心肌病与心肌肌钙蛋白I、T基因突变的关系，尝试用多种实验方法检测突变；克隆sD大鼠心肌肌钙蛋白I基因，构建一种肥厚型心肌病相关，CA肌肌钙蛋白I基因突变类型(Lysl84缺失突变，相当于人Lysl83)重组腺病毒载体，用于发病机制的研究。内容与方法：1．收集临床确诊的肥厚型心肌病病

6、例58例，提取外周血白细胞DNA。2．PCR扩增心肌肌钙蛋白I基因7、8号外显子，产物直接测序检测有无突变。3．PCR扩增心肌肌钙蛋白T基因8、9、11号外显子及心肌肌钙蛋白I基因5号外显子，采用单链构型多态性(single．strandconformationpolymorphism，SSCP)分析法检测突变。4．对新发现的突变设计相应的生物素标记寡核苷酸探针，斑点杂交进一步验证结果。5．RT-PCR法克隆sD大鼠心肌肌钙蛋白IcDNA，同时在eDNA两端引入AflII／NheI限制性酶切位点。6．采用定点突变技术(Site-directedmutagenesiS)构

7、建心肌肌钙蛋白ILysl84缺失突变eDNA，并做测序验证。7．PCR方法在突变及野生型的心肌肌钙蛋白IcDNAC端引入6XHiS标签序列。8．利用AflII／NheI双酶切将突变及野生的心肌肌钙蛋白IcDNA亚克隆至穿梭质粒。9．PI—SceI／I-CeuI双酶切重组穿梭质粒，分别将含有突变及野生的酶切片段亚克隆到腺病毒载体。10．PacI酶切重组腺病毒DNA，转染HEK293细胞。扩增收集重组腺病毒，分别用PCR和western印迹法鉴定构建的cDNA和目的蛋白表达。II．CsCl梯度超速离心法纯化重组腺病毒。12．开胸暴露sD大鼠心