EDS76病毒检测方法的研究双夹心ELISA、胶体金试纸条和PCR方法

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1、摘要减蛋综合征病毒(eggdropsyndrome一76virus，EDS．76virus)经过鸭胚增殖、氯仿抽提、聚乙二醇一6000(PEG一6000)浓缩处理，免疫110日龄鸡和成年兔，制备了高效价的鸡抗EDS一76、兔抗EDS一76病毒血清抗体；用健康兔纯化血清lgG免疫绵羊，制各了羊抗兔血清抗体。制各的血清抗体采用辛酸一硫酸铵分步沉淀法纯化。用鸡抗EDS一76病毒、免抗EDS一76病毒和羊抗兔三种特异性高免血清IgG，建立了双夹心酶联免疫吸附试验(Eenzyme．1inkedimmunosorbentassayELISA)检测法，试验确定的鸡抗E

2、DS．76病毒、兔抗EDS一76病毒和HRP．羊抗兔抗体的最佳工作浓度分别为1：160、1：300和1：1000。本法对纯化EDS一76病毒的最低检出量约为5ng，孑L。对EDS．76试验感染鸡脏器带毒、排毒情况和临床样本的检测表明，双夹心ELISA方法对EDS一76病毒的检测特异性强、敏感度高、适合于成批样本的检测。采用柠檬酸三钠还原氯金酸，制备胶体金颗粒。根据不同粒径的胶体金颗粒在检测时所呈现的颜色鲜艳程度，选择15nm的胶体金颗粒作为标记物。试验测得待标记抗体最低稳定量为40pg／mL；确定鸡抗EDS．76抗体和羊抗兔抗体的合适点样量为1“g。用试

3、纸条能检出浓度约为1．3即g／mL的纯化病毒，该试纸条的研制为进一步研究和开发一系列畜禽疾病快速诊断奠定了试验基础。为了更敏感的检测EDS．76病毒，以及监测病毒在鸡体内的存在时间，使用了PCR方法。按照EDS．76基因组保守序列设计合成一对特异性引物，用该引物对EDS-76基因组DNA进行了PCR检测，扩增山一条约300bp的片段，与预期结果一致。PCR方法检测的最低病毒DNA含量达到2．5×10一Pg，PCR检测表明，从感染鸡的心脏中不能检出病毒，肝脏和肾脏只有在排毒高峰期检出，在试验感染后4～21d的子宫、血液和4～17d的脾中均能检测到。用双夹心

4、ELISA、胶体金免疫试纸条、PCR和传统的HA—HI方法，分别对135份自然感染鸡样本进行了检测，其阳性检出率分别为66．7％、52．6％、74．8％和58．5％。用双夹心ELISA和PCR检测79例阳性样品(HA—HA方法检出的)，均为阳性：试纸条检出7l例阳性；与HA—HI法相比其阳性符合率分别为79／79=100％、79／79=100％、71／79=89．5％。由结果可以看出，4种方法阳性检出率由高到低的顺序依次为：PCR、双夹心ELISA、HA．HI、免疫胶体金试纸条。关键词：减蛋综合征；抗体；胶体金；双夹心ELISA；聚合酶链式反应；血红细胞

5、凝集抑制试验TheStudyontheDetectionAssaysofAntibodySandwichELISA,ColloidalGoldStripandPCRforEDS-76VirusAuthor：WangAi—huaSpecialty：PreventiveVeterinaryMedicineSupervisor：Prof．SunJi—guoAbstractEggdropsyndrome··76virus(EDS-·76virus)wasextractedwithchloroformandconcentratedwithpolyethyleneg

6、lycol一6000(PEG一6000)．Hyperimmuneseraofchickenanti—EDS·-76virusandrabbitanti··EDS·-76vireswerepreparedbyimmunizinginchickenandrabbitwithpurifiedEDS一76，Sheepanti-rabbitserumwasobtainedbyimmunizinginsheepwithhealthyrabbitimmunoglobulinG(IgG)．ThepurlfySCRimwereobtainedbycaprilicacid·

7、ammoniumsulfanrateprecipitation．AAntibodysandwichenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)wasdevelopedforthedetectionofEDS-76virusbyemployingthethreekindsofIgGoptimaldilutionsofchickenanti—EDS一76virus，rabbitanti—EDS一76viresandHRP—sheepanti-rabbitwere1：160，1：300andI：1000，respectively．

8、Theresultshowedthatitcoulddetectminimalt