真菌果胶甲基酯酶的重组制备及性质表征

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1、硕士学位论文真菌果胶甲基酯酶的重组制备及性质表征RecombinantPreparationandCharacterizationofFungalPectinMethylesterasef，o■．冬翕．‘、＼、≯、}0．‘作者姓名：匿鹏学科、专业：生物丝堂皇佥王生物堂大连理工大学DalianUniversityofTechnology大连理工大学学位论文独创性声明lIIIIIIIIIIIIIIIIUIY2414954作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢

2、的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：真菌墨堕里基醢酶丝重组剑鱼区丝厦麦堑作者签名：——坪年印乳日期：二业午—￡月蛊日大连理工大学硕士学位论文摘要果胶是一类富含多聚半乳糖醛酸的天然高分子化合物，是植物细胞壁的重要组成部分。果胶甲基酯酶能催化果胶的半乳糖醛酸链上的甲氧基去甲氧基化，因此具有降解果胶的活性。黑曲霉来源的果胶甲基酯酶在果汁生产中可

3、以有效控制果汁的澄清和浑浊，但黑曲霉能产生多种果胶酶，这些酶的生化性质相似，为果胶甲基酯酶的纯化带来困难，重组制备黑曲霉果胶甲基酯酶是一种可行、有效的方法。另一方面，黄曲霉分泌的果胶甲基酯酶是黄曲霉侵染植物时的致病因子之一，抑制该酶活性可控制黄曲霉对作物的侵染。另外，真菌来源的果胶甲基酯酶的催化机制与细菌及植物来源的不同，有必要研究真菌果胶甲基酯酶的结构和功能，但真菌果胶甲基酯酶的晶体结构还未见报道。因此，本论文以黑曲霉果胶甲基酯酶和黄曲霉果胶甲基酯酶为研究对象，分别对这2个酶进行了重组制备及性质表征。(1)黑曲霉果胶甲基酯酶的克

4、隆表达、分离纯化及性质表征克隆了黑曲霉果胶甲基酯酶基因，利用组成型表达载体pGAPZa在毕赤酵母中成功地分泌表达了该酶，而且无需甲醇诱导，避免了工业上甲醇诱导的不便。利用H汀rap¨ⅥQXL阴离子交换柱层析和ResourceS阳离子柱层析分离纯化得到电泳纯蛋白，其中比活力为342U／mg，蛋白纯化活力回收率为28％。对纯化后的重组酶进行了性质分析，得到Vmax茭j1．376mmol／(minxmg)，№为0．19％pectin(w／v)≈8．6mmol／L，Kcat岁--j8．26×103S一，最适温度为50℃，最适pH为4．7，

5、且该酶在30．50℃、pH4．0．6．0稳定性较好。该酶能够被K+、M92+、C02+、Mn2+、Ni2+离子抑制活性，Na+对酶活力没有影响。(2)黄曲霉果胶甲基酯酶的重组表达、分离纯化及其抑制剂筛选利用载体pPIC9在毕赤酵母GSl15中表达了黄曲霉果胶甲基酯酶基因。通过亲和色谱层析和离子交换两步纯化，得到了电泳纯的重组黄曲霉果胶甲基酯。对该酶进行了性质分析，其最适pH为4．8，最适温度为55℃，同时发现该酶对中等甲酯化度果胶表现出更强催化活性。通过抑制剂筛选，发现带有五倍子酸基团的植物多酚(EGCG)和绿茶提取物多酚(PP6

6、0)对该酶有抑制活性。(3)黑曲霉果胶甲基酯酶的原核表达及结晶条件研究黑曲霉果胶甲基酯酶和黄曲霉果胶甲基酯酶在毕赤酵母细胞中的表达，都存在不均一性的糖基化现象，糖基化不均一的蛋白质很难形成结晶，所以采用在大肠杆菌原核系统里表达这2个酶。研究发现黄曲霉果胶甲基酯酶在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，而黑曲霉果胶甲基酯酶在大肠杆菌系统里得到了可溶性表达。通过一步亲和层析进行了真菌果胶甲基酯酶的重组制备及性质表征黑曲霉果胶甲基酯酶的分离纯化，其纯度达到95％以上。利用Hampton公司的结晶试剂盒，初步筛选出3个适合该酶晶体生长的条件，并生

7、长出微晶体。关键词：果胶甲基酯酶；黑曲霉；黄曲霉；果汁工业；蛋白质结晶大连理工大学硕士学位论文RecombinantPreparationandCharacterizationofFungalPectinMethylesteraseAbstractPectinisanaturalpolymerfichedinpolygalacturonicacid，anditisanimportantcomponentofplantcellwalls．Pectinmethylesterasecatalysesthedemethoxylationo

8、fthehomogalacturonanchainofpectin，andthereforeithastheactivitytohydrosisthepectin．ThepectinmethylesterasefromAspergillusnige