一种广泛适用的RNA提取方法

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1、http://www.paper.edu.cn1一种广泛适用的RNA提取方法淳俊，郑彦峰，王胜华*，陈放四川大学生命科学学院，成都（610064）E-mail：shwang200@yahoo.com.cn摘要：分离提取高质量的RNA是基因表达、调控与基因工程等研究的基础，而RNase，多糖及多酚类物质严重干扰RNA的分离提取过程.本文利用硅藻土对RNase的吸附性，结合PVP，高盐及乙二醇丁醚沉淀等处理，建立了一种广泛适用的RNA提取方法．在富含多糖的玉米胚乳，富含RNase的动物肝脏，多酚多油脂的银杏、麻疯树以及木霉、酵母等10多种RNA提取困难的动、植物与微生

2、物材料都提取出完整性好，得率高的RNA；RT-PCR实验表明提取的RNA能够用于后续的分子生物学研究．此外，将分离提取的总RNA经过LiCl与PEG8000加NaCl沉淀步骤有效地去除了大片段RNA；经水稻osa-mir-156做成熟miRNA的RT-PCR验证，富集得到的小RNA可以用于miRNA克隆等后续实验．关键词：硅藻土，RNA提取，小RNA，乙二醇丁醚中图分类号：Q7811．引言获得完整性良好的RNA一直都是致力于基因表达调控研究的分子生物学者面对的挑战[1，2，3]性课题．尽管已经建立起了许多RNA的分离提取方法并开发出若干RNA的分离提取试盒．但是，

3、RNA酶、多糖、多酚等物质或者降解RNA，或者与RNA形成难溶物等方式[4，5，6]严重干扰RNA的提取，还是常常导致实验的失败．本文利用硅藻土能够有效吸附RNA[7，8]酶的特性，结合高盐，PVP及乙二醇丁醚沉淀等过程，建立了高效高质量RNA提取方法，并通过动物肝脏，灌浆期玉米胚乳，银杏叶片等中药材以及木霉等微生物材料证明其具有适应性广、经济高效的特点．另一方面，小RNA是基因表达调控的重要分子，在调控基因表达的基础理论研究以及[9,10,11]基因工程，基因治疗等方面极具潜力，已经成为国内外的研究热点．因而，我们在分离出的总RNA的基础上进一步富集了小RNA．

4、实验证明，富集的小RNA能够用于后续的研究工作．2．材料和方法2.1实验材料植物：富含多酚的麻疯树幼叶、蓖麻树幼叶、乌桕树幼叶、银杏树幼叶、芦荟叶片，富含多糖的灌浆期玉米胚乳，水稻幼苗，以及油脂丰富的麻疯树种子．动物：富含RNase的家兔肝脏．微生物：木霉、酵母．2.2主要仪器冷冻离心机：Centrifuge5804R（eppenderf公司）电泳仪：DYY-III1型稳压仪（北京六一仪器厂）紫外凝胶成像系统：BioIMAGINGSYSTEM（SYNGENE）紫外可见分光光度计：TU-1800（北京普析通用仪器有限责任公司）1本课题得到国家自然科学基金（编号：30

5、270090）和四川大学科研启动基金资助项目的资助。-1-http://www.paper.edu.cnPCR仪：Biometra公司生产的personalcycler2.3方法2.3.1主要试剂DEPC、EDTA购自Amresco公司，琼脂糖为Sigma公司产品，硅藻土、水饱和酚(pH4.7)、氯仿、异戊醇、5mol/LKAc(pH4.8)、75%乙醇、无水乙醇、乙二醇丁醚、SDS、柠檬酸钠、Tris、HCl、2-巯基乙醇、水不溶性聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、5mol/LNaCl、8mol/LLiCl、50%PEG8000、1mol/LMgCl2等均匀为国产分析纯

6、试剂.2.3.2溶液制备(1)硅藻土的处理：5g硅藻土用50ml50mmol/LTris-HCl(pH7.6)溶解，于100℃放置5min．室温，2,500g，离心5min．弃上清，沉淀用40ml50mmol/LTris-HCl(pH7.6)重悬．重复离心和重悬的步骤两次．超声1min．室温，3,500g，离心15min．沉淀用30ml50mmol/L[12]Tris-HCl(pH7.6)重悬．4℃储存．(2)硅藻土提取缓冲液：20mM柠檬酸钠pH7.0，10mmol/LEDTA,0.5%SDS,1%2-巯基乙醇，100mmol/LNaCl，1.9g/L处理过的硅

7、藻土.(121℃高压灭菌20min，冷却后再加入1%2-巯基乙醇,4℃保存)[13](3)异硫氰酸胍提取缓冲液：按文献的方法进行．实验所用的塑料制品均经氯仿处理5min后，121℃高压灭菌20min.玻璃、陶瓷器皿200℃干热灭菌8h.2.3.3总RNA的提取全过程均在冰上操作，保持样品温度在0-4℃2.3.3.1硅藻土法样品液氮速冻，于研钵中研磨成细微粉末并转入预冷的离心管，按照4ml/g的比例加入硅藻土提取缓冲液，充分震荡后加入1/2体积的水饱和酚和1/2体积的氯仿：异戊醇(24:1)，震荡混均．4℃12,000g离心10min，取上清加入等体积5mol/LK

8、Ac（pH