电化学DNA生物传感器的研究现状

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扮考渔渭击份电化学DNA生物传感器的研究现状刘俊芳，李彦青，郭满栋(山西师范大学化学系，临汾。41。。4)摘要:对电化学1)NA生物传感器研究的现状，主要对1996一2006年期间的工作作了评述。内容涉及此类生物传感器的研究及1〕NA修饰电极与小分子的相互作用，还对此领域的未来发展作了展望(引用文献49篇)。关键词:DNA生物传感器;探针;杂交中阁分雀昙:戊5文献标识码:A文章编号:1001一4020(2007)08--0701一04PrescntStatusoftheResearchesOnElectrochemicalDNABiosensorsLlt〕J阶f田19，LIYOn，qing，Gt」oh】a介山〕ng(刀e户乙of以砂豆ry，Sha心iN‘护刃翻二1以妇二妙，L仍介n。牡。。选，Ch诬二)Abstr.〔t:A妙wonthepresentstatusofresearchesonelec加cll喇call〕NAbiosensors，cover互呢m面nytheye习丈sfroml996一2006，was肥阿喇inthisp叩改，rehtedespeolallylhepreparationof士卜eliosensorsandtheint~。。nofl〕NAmodilieddect田deswithsmallmolecules.AprosPectionforthefuturedeve1opment1nthisfialdwas旧15oglven(4greLcited).Ke州。川5:nN八biosenoor;Probes;Hybl记让ation随着基因工程的迅速发展，分子诊断技术在过诊断D卜A分子的方法，对药物分析、临床检测及生去几十年里得到了长足的发展。在分子诊断技术和物工程都有着十分重要的意义山〕。药物研究过程中，基因序列的分析和基因规则的研1乃A生物传感器对基因序列的明确分析近年究起着非常重要的作用，基于基因序列分析的分子来得到了快速发展，随着1觅A合成技术以及与微诊断，已为传染性疾病抗原及其基本变化的研究提电子技术的发展，1〕NA生物传感器的发展更趋于完供了较高的灵敏度和优良的定性方法。由于简单善。电化学DNA生物传感器〔州是近年来发展起化，脱氧核糖核酸(DNA)杂交生物传感器在直接检来的一种新型的生物传感器。它能将目的1〕NA的测中更为普遍应用存在转换为电信号，因为本身具有灵敏度高、成本DNA杂交后，靶与其互补的探针形成Watso。低、易操作、简单化、并能与其它仪器兼容的特Crisk双链DNA。DNA探针一般是短链单股1〕NA点际剑，因而发展非常迅速。本文就近年来电化学片段(14一35mer)，它可以用放射性元素标记的探DNA生物传感器的研究进展作出评述。针进行杂交检测，尽管它的灵敏度很高，但放射性标记的探针寿命短，对人体有伤害，而且价格昂贵，对1电化学DNA生物传感器的制备操作人员要求较高，因而限制了它的应用。同时，无电化学DNA生物传感器和其它的生物传感器放射性探针可以用荧光或化学发光等标记，就其设一样，包含两部分，即分子识别器件(DNA)和换能计和应用而言，探针和所使用仪器比较昂贵，在实际器(电极)。识别器件—探针(。sDNA)，探针用来应用中也难于推广。因此，发展快速、简单、无标记感知样品中是否含有待测物质，它与待测样品靶(SsDNA)杂交，形成Watso。已ick双链(dsDNA)收稿日期:2o060主一26作者简介:刘俊芳(1975一)，女，山西临汾人助理实验师，研究杂交在电极上直接完成，根据杂交前后电信号的变方向为生物电化学化量推断出被检测的DNA量。由此可看出:电化万方数据·701 刘俊芳等电化学DNA生物传感器的研究现状学DNA生物传感器的制备大体可分为两个步骤，杂交是两股核着酸碱基互补(鸟喋吟与胞嗜陡即DNA探针的固定和实现测定信号的相互转换。互补，腺喋吟与胸腺咯吮互补)，通过氢键形成双螺1.IDNZ、探针的固定旋DNA的过程。如图1所示:在1〕NA生物传感器的制备中，探针的固定起//之之2今丫2//{01A1T}0}C1C着至关重要的作用。探针有效固定，不仅能提高传乙乙乙乙乙少址之丫卜1·1;!!l感器的灵敏度和选择性，还能消除不明确吸附。有于二丁百否忑一罕T个呀罕甲效地控制探针在电极表面的覆盖度、固定方向及其探针固定靶物杂交稳定性，对杂交的成功检测十分重要。翻1】〕卜IA杂交过程目前，探针的固定法主要包括吸附法、组合法和氏叮seofl〕N人]wbridizat】on共价键合法。吸附法固定探针是最简单的方法。它是将探针通过吸附作用固定到预处理过的电极对于在电化学DNA生物传感器上发生的杂上川。对洁净的电极进行活化，在电极表面产生一交，溶液的离子强度、杂交温度、杂交时间和探针的层亲水性界面，通过此界面将探针固定于其上阔。长度都会影响杂交效率。随着溶液的离子强度上升还有报道将抗生物素蛋白(av记in)吸附到电极上，至3.Zmol·U‘，杂交效率升高洲，但同时不明确通过抗生物素蛋白一维生素H(avidi，biotin)的组合吸附也会上升。因此，太高的离子强度会引起错配。作用将探针固定到电极表面叼。然而，这种装置不Wal〕9等嘟〕证明在杂交溶液中加人氯化钠会使分析能严格清洗，因为它不是共价键合，在杂交过程中可信号提高。温度也强烈影响杂交的效率，形成能脱附，而且1〕NA结构会发生扭曲，使固定的DN卉DNA双螺旋结构的最佳温度应选择在20一DNA无法进行杂交，因而杂交效率很低。因此，吸25℃，因为在20一25℃温度范围内DNA杂交动力附法没有成为1)NA杂交传感器制备的主要方法。学效果最好)〕。因此，严格控制温度和离子强度，共价键合法是固定探针比较理想的方法，在制备可以区分错配与互补杂交叫。Wang等[20〕已报道，1)NA电化学生物传感器中得到广泛应用。通常它长链探针和靶会降低杂交检测的灵敏度，这可能是是通过化学键将探针固定到电极上，根据不同的电由于空间位阻引起的。杂交的速度与溶液的pH值极表面，可以采用不同的键合方法。也可在玻璃碳无关卿〕，但杂交一般在pH7左右的磷酸缓冲溶液电极上利用水溶性碳二亚胺(Elx二)和N-烷基瑰拍或柠檬酸缓冲溶液中进行。杂交时，在外电路条件酞亚胺(NHs)[lo〕将探针连于电极。对于金电极，主下外加电压会使杂交效率上升叫。为了降低不明要是利用金能与硫能形成金一硫键，一种方法是通过确吸附，对杂交时间、探针和靶的浓度优化是必不可琉基标记的探针将其固定到金电极[ll从另一种方法少的一步。控制杂交时间能够调整杂交动力学的线是在金电极表面通过带有疏基的小分子形成一层单性范围，短的杂交时间会使杂交效率非常低，时间控分子膜，通过此单分子膜与标记探针进行化学键合，制在5一60min内，检出限从纳摩变化到皮摩，灵敏将探针固定到电极[l2〕。度提高了3个数量级。缓冲溶液、固定温度、固定时间、链的长短等因1.3电信号转换素对探针的有效固定均有影响。Lucarell产1曾证信号转换是将目的DNA分子的存在转换为电明在乙酸缓冲溶液中固定探针，能获得很好电信号，信号，通过电信号的变化来判断杂交发生的程度。一般固定温度选择在20一25℃为宜，固定时间根据电信号转换一般通过在DNA分子上标记活性基团具体条件而定，探针长度一般为14一35个碱基或使用电活性杂交指示剂，这叫做标记检测;另一种1.2杂交是无指示剂标记检测，这种检测是用鸟昔代替探针迄今为止，大多文献报道的电化学L)NA生物中的鸟漂吟，由于鸟普和鸟嗓吟的电活性不同，可以传感器的灵敏度还不可以直接分析基因序列，对于通过检测靶中鸟嚓吟的氧化信号来检测杂交。DNA序列的研究几乎都是用已知序列的DNA，用1.3.1标记检测PCR扩大法与DNA生物传感器结合进行有效的杂(1)用具有电活性的杂交指示剂作为识别元素交检测的报道仅有几例[l’」，无PCR扩大、酶标记、电活性杂交指示剂是一类能与单股DNA直接的DNA杂交检测则更少[l5，15]。(551〕NA)和双股】)NA(dsDNA)以不同方式相互作万方数据 潺一一一-一—一卫价工塑辫塑吟用的电活性物质。它的电活性可以使检测电流增1.3.2无指示剂检测大，提高检测的灵敏度。当杂交发生时，随着指示剂无指示剂法已得到广泛关注，而且是DNA杂的浓度在电极表面上升，电化学反应上升，因此，它交检测的发展趋向。无指示剂法检测是通过控制杂可以有效的区别551〕NA和dsDNA。目前，使用的交中电化学参数的变化来完成的。这种传感器方案杂交指示剂包括亚甲基蓝、麦尔多拉蓝、道诺霉素和简单，因为它不用指示剂，检测安全，指示剂引起毒金属配合物等。性污染作用被消除，而且还避免了与致癌性物质的亚甲基蓝洲属于酚唆嗦类，由于它与鸟嚓吟有接触。第一个无指示剂杂交方案由Wang提出〔刘。明确的反应，所以它可以作为一种很好的杂交指示通过用鸟昔山州来代替鸟膘吟，鸟普也能与胞嚓陡剂。AlzumErdem等以亚甲基蓝为指示剂对短链形成具体的碱基对，但它电活性比鸟嘿吟低三个数肝炎B病毒基因进行检测。麦尔多拉蓝是一种有量级。用鸟昔代替鸟嗓吟的探针与正常靶进行杂交效的电子接受体，它的酚唆啼结构能使电子在双核检测，通过计时电位法对靶中鸟喋吟氧化检测，靶的昔酸和电极表面穿梭，它插人dsl〕NA中，没有封闭检出限可达0.12mg·1厂‘[3‘〕。Lucarelli等[33」利用它的电活性，所以它可以作为一种杂交指示剂。这样一个传感器对人血PCR真实样品的DNA阿Kara等哪〕曾以麦尔多拉蓝为指示剂对抱疹病毒工朴蛋白E进行了基因检测。和n进行区别。道诺霉素是一种葱环类化合物，具ZDNA修饰电极与小分子的相互作用研究有平面分子结构，可以插人dsl〕NA相邻碱基对之间并与dsL水A双螺旋产生强烈作用，这使它成为DNA生物传感器对环境监控〔3摊〕、病原体基因众多抗癌药物中应用较多的一种，尤其用于对急性检测〔俐们、基因疾病的诊断脚明、药物机理分析哪〕白血病治疗。Barton等比〕证明道诺霉素是一种插起着十分重要的作用。通过DNA修饰电极界面，入式氧化还原杂交指示剂。对金属配合物困，主要不仅能检测到小分子，而且还能分析DNA与小分是利用它的氧化还原电位，能与DNA有强烈的亲子的作用机理。合作用，并具有化学稳定性。通过它在电极上的反苯并毗是一种环境污染的代谢产物，它可能会应电流或电位强弱来判断杂交。Baokangjin等曾引起癌变或诱导基因突变，是一种严重的致癌物质。用CO(phen)扩为指示剂在金电极上对1〕NA进行KerTnan等[41〕利用电化学1〕NA生物传感器对苯并杂交检测。毗与1〕NA的加合物进行了研究，由于苯并砒与(2)核昔酸与电活性官能团相连，以电活性官DNA中的鸟嗓吟相互作用，形成】〕NA-苯并毗加合能团作为识别元素物，降低了鸟嗦吟的氧化信号。抱疹基因病毒有两合成标记核昔酸与电极表面的靶基因选择的进种:抱疹病毒工和抱疹病毒11，这两种病毒有相似的行杂交反应，在电极表面形成带有电活性官能团的抗原基因。抱疹病毒1一般在婴儿或儿童期感染，杂交分子，通过测定其电信号可以识别和检测DNA它会影响唇、口腔、鼻、领等部位，而抱疹病毒n会引分子。HafsaKorri一Youssou工1等，，]用带有二茂铁起基因性毒疮。PinarKara等用PCR扩大真实样毗咯和竣酸毗咯聚合，与二茂铁相连的毗咯有一个品法，对抱疹病毒工和n进行区别，以麦尔多拉蓝为易离去的脂基，用氨基标记探针代替这个脂基，通过指示剂，通过检测麦尔多拉蓝在dsl〕NA中的微分检测二茂铁的氧化还原信号来判断杂交是否发生;脉冲电压区分出抱疹病毒工和抱疹病毒n口KeTTnan等哪」曾将1冰A探针连于生物磁性珠上，Rad产叼等使用D卜A生物传感器检测喳琳药物在与错配靶杂交，再用金纳米粒子标记的核普酸检测1)NA/玻璃碳电极表面的反应，当dsl〕NA不存在错配基，通过电化学方法对单碱基多态性进行解译;时，得哇琳药物氧化峰，随dsl)NA浓度上升，喳琳为了提高电流响应值，可以通过将银纳米粒子沉积药物的氧化峰降低，当dsDNA浓度为5.。拜mol·到金纳米粒子上的方法渺〕来检测杂交。CalH.等L一1时，氧化峰消失。这证明峰电流的降低是由于曾用金纳米粒子标记靶与探针进行杂交，然后，在金哮琳药物与dsDNA形成加合物的扩散引起的。纳米粒子上沉积一层银纳米颗粒，通过微分脉冲法3结论检测银纳米颗粒的电信号来测定杂交，这种检测比用金纳米颗粒标记检测的灵敏度高90多倍。过去几十年里，对DNA生物传感器的电化学.703万方数据 绪形澎溺刘俊芳等:电化学DNA生物传感器的研究现状研究已得到很大进步。由于这种装置简单、灵敏度「12]OzkanD，Erd朋A，KaraP.etalElectroch绷istry高、选择性好、快速、便宜的特点，已经引起了人们的CO二unicationsLJ』，2002，4:796广泛关注。LucarellF，凡celaA，Palchetttil，etaL线。elect丁。cl，mistry二J卫，2002，58:113.目前，对探针的固定仍是制备整个装置关键的厂14刁M是rrazzaG，ChitiG，MsciniM，etal.ClinC吮m一步。一般来说，有效的将探针固定到电极表面，对网仁J卫，2o00，4G:31.控制电极表面1州A分子的覆盖度，消除不明确吸D〕wnsMEA，WarnerPJ，TurnerAPR压。姗te附，提高杂交效率十分重要。在金电极表面通过金-叫nals[Jj，1998，9:66硫键形成一层单分子膜是固定探针的一种优良的方MillanKM，SpunnanisAJ，MkkdsenSRElec法。由于许多电活性指示剂不仅与ssDNA反应，皿troanal”15[J〕，1992(4):，29-还和dsl〕NA反应，这严重限制了杂交灵敏度，所以HamesBD，HigginsSJ.OxFOrdUniversityPxess无指示剂杂交检测是当前的挑战。就】〕NA生物传叫Oxforil[J]，1985:78-感器的实用性而言，碱基错配技术是1)NA杂交检WangJ，Ri二sG，CaiXElectroanalysls[J〕，1997，9测的挑战。利用酶标记是目前超灵敏的杂交检测，(5):395.尸，0匕︺Mil-lanKM，SaraulloA，腼kkelsenSR.Ana1Ch叽因为它能在无PCR扩大条件下进行定量分析。磁[Jj，1994，66:2943-厂﹃n八性珠的使用消除了不明确吸附问题，然而它的信号一曰一一︸、，a叱J，caiX，Ri翎sG，etal.八刀a1Che。仁J〕，转换和分离步骤与通常生物传感器却不同1996，68:2629.尸es‘勺，卫寻找新型的嵌合剂和载体材料，选择优良的换LWa明J，R;。sG，C。;又Ele:切analysis仁J」，1997，，能器，优化电极表面结构，使电化学1)NA生物传感画(5):395，器进一步向微型化、商品化方向发展，这对环境监WogJ，RlvasG，ParradoC，etal.Talanta仁J]，测、疾病基因的诊断、药物分子在人体中治病机理等皿1997，44:2003.方面的需要显得尤为突出。电化学】)NA生物传感KelleySO，BartonJKBioconjugChe。[J〕，1997，训8:31.器的出现为解决上述难题提供了一个强有力的工KaraP，M.ricB，ZeyLinogluA，etaLAnalChetn具。尽管目前这种传感器仍处于初级阶段，但它的颐Acta口]，2004，518:69.未来对生物诊断领域的巨大影响是不容忽视的。KdleySO，肠onEM，E以rto艺IJK，etal.Nu已leic参考文献:匹AcidRes[J口，1999，27(24):4召30.ZhuNN，CaiH，HePG，etaLz初‘【IChemActa[1〕Olivel抢BrettANM，Vi馏IM，FemandesIR，已t己.队[J口，2003，451:181-Talanta[J]，2002，56:959.Korr卜YOussouf;H，Makl℃uf且人口目Ch皿Acta[Jj仁2己zhuZw，uc，L;NQ硒croche功1oaljournal[J」，2002，469:85.2002，71:57.[28习Kelll习nK，SaltoM，入1oritay，etal.J勺lalChem〔3]Mal，Scalea，Shps二，Eiferreira，et。1.Pharma-皿[J]，2004，76:1877.ceuti二landBiom祖ica1Analysi斑J〕，2叨2，29:561，W习ngj，PolskyR，D习nke儿工旧。团11Llir[J〕，2001，[4」Wa明J.ChetnEllJ「J]，1999，5:1651，血17:5739-「5]MikklesenSRElectroanal邓15日口，1996，815.Wa眼J，CaiX，T访nl3，etal.J七lal邓t[J]，1996，[6」PalecekE，R云taMAl司Chern「J丑，2001，73:75入[121:3965.l:[7〕wangJ，CalX，Riva，G，etal.An旧IChoActa[J口，WangJ，RlvasG，凡rnandesJR，etal.Ana1Chi印1996，326:141-Acta口口，1998，375:197.︸1I门弓口口[8]WangHuaisheng，JuHuangon，C阮。Ho眼yuan-J一wangJ，KawdeAN，价d二A，etal.Analyst仁JI，AnalChemAc加[J〕，2o02，461:2432001，126:2020.r﹁9Q一L〔9〕F日11gX，LiuX，凡11usters，etal.AmChen1Soc[J〕，门少曰LucarelliF，MarrazzaG，Palchetttil，etal.八nal1999，121:2921，网C12imActa口」，2002，469:，3.[1。」MillanKM，SP二aniSAJ，腼kkelsens凡Ele。-KermanK，Montay，Takan1LlraY，etaLElectrot，自自nalysis[J]，1992，4:929-叫chemistryCommunication口〕，2003，5:887.[11]HelasCMYau，ChanHL，孔飞MBiosensorsw日1gJ，RivasX，恤ix，etal.AnalChimActa[J〕，an〔]Bioelec如nics[J〕，2003，15:8731997，347:1.(下转第706页)704，万方数据 吴诚金属材料分析方法的选择和施行第六讲金属材料中稀土元素的测定(续)两元合金体系具有重要的工业价值。例如错、锰与大且不均匀为其主要问题。错的加人使镁合金的晶镁能形成包晶型合金体系，钻在镁中的固溶度为粒细化作用明显，如镁一锌一铅系合金中总错含量在3.8写，锰在镁中的固溶度为3.4%;又如银、铝、锌、二(Zr)0.5%一1.。写之间，溶解性错w(Zr))铿、牡、忆、钦、斓等则能分别与镁形成共晶型合金体。.5%，但是加错的镁合金的铸造性能较差。在镁-系，这些元素在镁中的固溶度依次为15.5%，锌一错系的基础上加人稀土元素成为镁一锌一错一稀土12.7%，8.4%，5.7%，4.5%，12.5%，3.6%及系合金。稀土的加人改善了镁一铃错系合金的性1.9%。以上这些金属元素与镁所形成的两元合金系能，而且其耐热性能也明显提高。例如下列牌号的成为了工业用镁合金的基础。锰能显著提高合金的镁合金均含有稀土二ZMZ，ZM3和ZMS，ZM4，zM6耐蚀性能，而钻能细化合金晶粒，提高力学性能。但和ZMg，其中稀土元素的含量最低者为w(RE)锰、错不宜同时加人作为镁合金的组分，因为锰与错。.75环，最高者可达w(RE)4%，加人不同稀土元之间能形成稳定化合物，使错在镁中的固溶度降低。素带来的性能改善是有差异的。ZB3和ZM4合金按照我国的合金体系镁合金分为两大类，变形镁合中加人的为饰，ZM6合金中加人铰，Zh49合金中加金和铸造镁合金，而变形镁合金又按其合金体系分人忆。已有数据说明由于不同稀土元素在镁中的固为三类，即镁~锰系，镁一铝一锌系和镁辞铬系，镁锰溶度随原子序数增加而有增加，各稀土元素对镁合系合金中，牌号为M创合金是在镁锰之外加人了少金的热处理及力学性能按以下次序递增:La、混合量钵〔w(Ce)o.15%一0.35%j，使合金除了具有良稀土、钵一钦(错)。特别耐热铸造镁合金中有镁针好的耐蚀性和焊接性之外，又使其强度提高超过系和镁银系两类合金。牡加人于镁合金中可改善镁40MP。，可进行各种压力加工。合金的铸造性能和可焊性能而且提高了合金的耐热在镁一锌~铭系合金中，MB22及MB25两种牌号性能。美国HK31A和HZ32A两个牌号的镁合金的合金中除锌、错两合金元素之外，都加人了忆。即为实例，前者的组分为MgTh3一Zro.7，后者的侧田22合金中忆的含量为w(Y)Zrg写一3.5%，改组分为MgesTh3一ZnZ.2一Zro.7。由于作为镁合金善了合金的塑性，提高了强度，高温性能也优于不含的合金元素，稀土和牡的作用相似，故在合金中不同忆的合金。MB25合金中忆的含量稍低一些〔二〔Y)时加人稀土和牡。银加人到镁稀土错系合金中可改。.7写一1.7%〕，除了改善塑性外，合金的室温抗拉善其时效效应和提高强度，而且其铸造和焊接性能强度、屈服强度及高温瞬时强度都得到改善。铸造也很突出。牌号为QE22的镁合金含银二(Ag)镁合金中中分为无铅铸造镁合金，含错铸造镁合金2.5%，铰，(Nd)2.。%和错二(Zr)。，7写。在我国和特殊耐热铸造镁合金三类。不含错的合金主要是镁合金系列中牌号为2M7的Mg一2，AgZr系合金镁一铝一锌系合金，此类合金的时效硬化效果很好，强中银含量在w(Ag)0.多%一1.2%之间。度较高，流动性和压铸性能好，价格便宜，但晶粒粗(待续)(上接第704页)网二36〕Ma~G，既ianellal，Masci血MAnalCh皿ActaMericI3，KeTmanK，OzkanD，etal.Tal朋ta[J」，[J〕，1998，387:297-网2002，56:837.二37且SioltorouCG，NikoleisDP，腼erni阮A，etal.Elec--决YK，ZhaoJH，YanF，etal.Biosensorsa工ldB认1-t二him爪ta口」，1998，43:3611.electro毗5口〕，2003，18:1501.厂﹁月~斗﹄一曰[38口SiontorouCG，NikoldsDP，TarusB，eta].曰ec-习MandongGuo，YanQ匕ILLFBioelectrochemist口troanaly，15[J口，1998，10(10):691.[J]，2006，70:245一249.r刁‘~卜「39]Chl寸iG，MS二zzaG，MasciniMAnalCh而ActaL号﹂EliciaLS认rC咫，EdithChow，JJustinGoo山飞.[J〕，2000，427:155-叫LangllL又比J〕，2005，21:6957一6965.[40〕助c沮℃11iF，KicelaA，Palchetttil，etal.BioelectrO-PratixaPJos卜1，St叩henAMe耐1阳t，Youdanwangch咖stly[J〕，2001，5吕:113.网AnalChetrl[J〕，2005，77:3183一3188.[4lj践二nK，MlricB，OzkonD，etal.儿班ICllllActaZhuZW，LIC，LINqMicroch二aljournal〔J口，[J〕，2001，450:51.2002，71:57.[42口AsekF，GrossiordC，JoannesM，etal.Anal且0-〔49〕Rad1A、EIRiesMA，KandilSAnalCh而瓜加[J」，ch已刀LJ]，2000，284:107.2003。495.‘1_·706甲万方数据