《基于电化学dna生物传感器的核酸检测新方法研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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‘重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明巧呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了义中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。一申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担切相关责任。学位论文作者签名；日期：九１户年Ｊ７学位论文版权使用授权书；本人完全了解重庆医科大学有关保护知巧产权的规定，即研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和鶴盘，允许论义被查阅和借阅。学校可Ｗ么布学位论文的全部或部分内容，可Ｌ乂采用影印、（保密内容除外），并编入有关数据库进行检索缩印或其他手段保存论文。保密论义在解密后适用本授权书。论文作者签名：來每、指导教师壑名：－日期。＾－１＾．：么 目录英汉缩巧语名词对照１中文摘要２英文巧要４论文正文：基于电化学ＤＮＡ生巧传感器的核换险測新方法研究７第一章巧于巧环护増巧金纳米技术实现沙口氏苗快速和巧灵敏检测的电化学巧策巧７１引胃７２实验巧分８３结巧与讨论１１４小结１９参考文巧２０第二章基于巧巧外切巧…辅助循巧扩増和错配型塞环巧化自组装技术离灵和高特异性艳測巧用型ＤＮＡ２４１引胃２４２实验部分２５３结果与讨论２６４小结３４的文巧３５文献综巧４０＆ｍ５２攻读硕±期间巧写的文章目录５３ 館医科大学硕主巧巧生学位论文英汉缩略语名词对照英文缩写英文全巧中文全敌ＤＮＡＤｅｏｘｙｒｔｏｏｓｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ脱氧梭糖核酸ＲＮＡＲｉｂｏｓｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ核糖棱酸ＲＣＡＲｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｎｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ滾环扩增ＥＬ－ＩＳＡＥｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔａｓｓａｙ酶联免疫吸附试验ＰＣ民Ｐｏｔｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｉｏｎ聚合酶链式反应－ＣＦＵＣｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｕｎｉｔｓ菌落形成单位ｇＡｕＮＰｓＧｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ金纳米粒子ＩｎｖＡＩｎｖａｓｉｏｎｒｏｔｅｉｎＡＡ侵袭蛋白ｐ－－－ｍｅｒｃａｔｏ－－＾ＭＣＨ６ｐ１ｈｅｘａｎｏｌ６妾蒂基己醇－ＡＰＳｔ－－ＳＴｒｅｐｔａｖｉｄｉｎａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ链霉亲和素碱性麟酸酶－ａＮＰａ－ｎａｈ－ｐｔｈｙｌｈｏｓｈａ化ａ蔡軟麟酸盐ｐｐＢＳＡＢｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ牛血清白蛋白ＴＥＭＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃ防ｓｃｏｐｉｃ透射电子显微镜ＤＰＶＤｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｕｌｓｅｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｐｙ示差脉冲伏安法ＥＩＳ巨ｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｍｐｅｄａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ电化学阻抗谱ＳＷＶＳｑｕａｒｅｗａｖｅｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ方波伏安法ＲｅｔＥｌｅｃｔｒｏｎｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ电子转移阻力ＲＳＤ民ｅｌａｔｖｅｓａｎｄａｒｄｄｅｖｉａ１：ｏｎｉｔｉ相对标准偏差Ｂ；ＢｒＥｌｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ漠化乙锭ＥｘｏＩＩＩＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩ核酸外切酶ＩＩＩＥＲＡ巨ｘｏｎｕｃ－ｌｅａｓｅＩｌｌａｓｓｉｓｔｅｄｔａｒｇｅｔｒｅｃｙｃｌｉｎｇ核酸外切酶ＩＩＩ辅助祀物质ａｎｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ循环扩增ＣＨＡＣａｔａｌｙｔｉｃＩｍｉｒｐｉｎａｓｓｅｍｂｌｙ茎环催化自组装ＰＡＧＥＰｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｅｌｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓ聚丙帰醜胺凝胶电泳ｇｐ１ 医科大学巧壬研維学位论文基于电化学ＤＮＡ生物传感器的孩酸拴测新方法研究摘要ＤＮＡ，脱氧核糖核酸，是体内所必需的Ｈ大分子（连同ＲＮＡ和蛋一。白质）之，对所有已知的生命形式至关重要最近几年，核酸作为识别和监测生物分子的工具，其应用日益増多。传统的ＤＮＡ检测方法既费时又费力。因此，建立快速、灵敏和简便的ＤＮＡ检测方法是非常有必要的。由于电化学ＤＮＡ生物传感器具有使用简便、响应快速、成本低和设备价格低廉等独特优势，能克服传统方法的局限化将ＤＮＡ一检测带入个新时代。本课题主要研究电化学生物传感器对ＤＮＡ检测的新方法，该方法能够高灵敏和离特异性的检测ＤＮＡ，为临床诊断、食品安全、生物威胁和环境监测等领域的ＤＮＡ检测提供有力的工具。本研究主要包括Ｗ下两部分：１．基于巧环扩増和金纳米巧术实现沙口氏苗快速和扭录敏抢測的电化学巧策路结合滚环扩增和金纳米探针双重放大技术一，本研究建立了种快速和超灵敏检测沙口菌的新颖的电化学传感策略。首先，鞭ＤＮＡ被固定在电极表面的探针１特异性捕获。然后将预先制备好的环化产物力口到电极上形成典型的Ｈ明治结构。在ｄＮＴＰｓ和ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶存在下，可滚环扩增产生微米级的包含串联重复序列的单链ＤＮＡ分子。最后，金纳米检测探针能与滚环扩增产物特异性互补结合，导致酶促电。在最优的实验条件下化学信号的产生，本研究设计的电化学传感器在ＩＥＤＮＡ浓度为－ｌＯＭ内呈ｌＯａＭｐ现出良好的线性关系，并且有超髙２ 齡医种大学硕±研触学位论文的灵敏度６．７６ａＭ。，此方法被用于实际样本牛奶，最低检测限为同时ｉ中沙口菌的检测，最低可检测６ＣＦＵｍｌ／的细菌。因此，该电化学生物传感器可Ｗ为临床诊断、食品安全和环境监测等领域提供强有力的工具。２．基于核巧外切巧…辅助循环扩増和错配型茎环值化自组装技术巧灵蜘巧特异性栓測通用型ＤＮＡ基于核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环扩增和错配型茎环催化自组装双重放大策略一，建立了种新颖的高灵敏和特异性的ＤＮＡ检测方法。在本实＇－，形成３验中，帮ＤＮＡ首先与茎环Ｈ０通过碱基互补配对相结合平末＇－端平末端进而逐步催化去除单核脊酸，。核酸外切酶阳能识别３释放一出祀ＤＮＡ和输出ＤＮＡ。释放的靴ＤＮＡ又能进入下个杂交和裂解过Ｉ）１，。程（循环。输出ＤＮＡ能与茎环Ｈ结合打开曲的茎环结构接一着茎环Ｈ２与被打开的茎环Ｈ１结合，释放出输出ＤＮＡ，其能促发下－Ｈ２复合物的形成个茎环催化自姐装循环和Ｈ１（循环ＩＩ）。最后，金电－Ｈ２复合物杂交极上的捕获ＤＮＡ能特异性地与Ｈ１，导致酶促电化学。ＮＡ浓度信号的产生在最优实验条件下，本研究设计的传感器在範Ｄ－为１００Ｍ５ｎＭ内呈现出良好的线性关系，最低检测限为％ｆｌＶｌ。该方法己成功应用于人正常细胞总ＤＮＡ和血清样本中ＤＮＡ的检测。本传感策略有望成为临床诊断和治疗、病原菌检测和环境监测等领域检额！１ＤＮＡ的强有力工具。，，，关键词；电化学ＤＮＡ生物传感器滚环扩增金纳米粒子核酸外切酶阻，茎环催化自组装３ 戯医科大学雨±巧触学位论文ＥＬＥＣＴＲＯＣＨＥＭＩＣＡＬ－ＤＮＡＢＩＯＳＥＮＳＯＲＢ乂ＳＥＤＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳＤＥＴＥＣＴＩＯＮＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＡＢＳＴＲＡＣＴＤＮＡ，ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ，ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｍａｊｏｒｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（ａｌｏｎｇｗｉｔｈＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓ）ｉｎｔｈｅｂｏｄｙｔｈａｔａｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｏａｌｌｋｎｏｗｎｆｏｒｍｓｏｆｌｉｆｅ．Ｉｎｒｅｃｅｎｔｅａｒｓｔｈｅｒｅｈａｓｂｅｅｎａｎｙ，ｔｏｏｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｔｈｅｕｓｅｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓａｓａｌｉｎｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎａｎｄｍｏｎｉｔｏｒｉｎｏｆｍａｎｃｏｍｏｕｎｄｓ．ＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒＤＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎｇｙｐａｒｅｃｕｍｂｅｒｓｏｍｅａｎｄｔ－ｆｏｒｅｌｉｈａｉｍｅｃｏｎｓｕｍｉｎ．Ｔｈｅｒｅ化ｉｓｕｒｅｎｔｔｏｅｓｔａｂｓｇ，ｇｒａｉｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｉｌｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｍ．虹ｏｒｄｅｒｔｏｐ，ｐｉｍｒｏｖｅｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｔｈｅｎｅｗｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡｐ，ｂ－ｔｉｏｓｅｎｓｏｒｂａｓｅｄｍｅｈｏｄｓｈａｖｅｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｓｏｔｅｎｔｉａｌａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｔｏｐｂｒｅａｋｔｈｅｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋｓｏｆｔｈｅｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓ，ｂｅｃａｕｓｅｔｈｅｙｈａｖｅｄｉｓｔｉｎｃｔａｄｖａｎｔａｇｅｓ，ｓｕｃｈａｓｅａｓｙｔｏｕｓｅ，ｒａｐｉｄｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｌｏｗｃｏｓｔａｎｄｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｉｎｏｕｒｗｏ化ｔｗｏｈｉｇｈｆｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓｈａｖｅｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｅｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｐ，ｗｈｉｃｈｗｏｕｌｄｂｅｃｏｍｅａｏｔｅｎｔｉａｌｔｏｏｌｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｄｉａｎｏｓｉｓｆｏｏｄｓａｆｅｔｐｇ，ｙ，ｂｉｏｔｈｒｅａｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｍｏｎｉｔｏｒｉｎ．Ｔｈｉｓｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｇｉｎｃｌｕｄｅｓｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｔｗｏａｒｔｓ：ｇｐ１．Ａｎｏｖｅｌｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ说ｕｓｉｎｇｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｒａｐｉｄａｎｄｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａｂｙｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ－ＡｕＮＰＤＮＡｓｒｏｂｅｐＡｎｏｖｅｌｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｅｎｓｉｎｓｔｒａｔｅｗａｓｄｅｖｅｌｏｅｄｆｏｒｇｇｙｐｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａｂｙｃｏｍｂｉｎｉｎｇｔｈｅｒｏｌｌｉｎｇｆｉｃａ－ｃｉｒｃｌｅａｍｌｉｔｉｏｎｗｉｔｈＤＮＡＡｕＮＰｓｒｏｂｅ．ＴｈｅｔａｒｅｔＤＮＡｃｏｕｌｄｂｅｐｐｇｓｅｃｉｆｉｃａｌｌｃａｔｕｒｅｄｂｒｏｂｅ１ｏｎｔｈｅｓｅｎｓｉｎｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｔｈｅｎｔｈｅｐｙｐｙｐｇ４ 重庆医科大学硕壬研巧生学位论文ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｍｉｘｔｕｒｅｗａｓａｄｄｅｄｔｏ拓ｒｍａｔｙｐｉｃａｌｓａｎｄｗｉｃｈｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｉｎ化ｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｄＮＴＰｓａｎｄｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，化ｅ民ＣＡｗａｓｉｎｉｔｉａｌｌｅｄ－－ｔｏｒｏｄｕｃｅｍｉｃｒｏｍｅｔｉｅｒｌｏｎｓｉｎｌｅｓｔｒａｎｄＤＮＡ．Ｆｉｎａｌｌｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐｇｇｙ，－ｌｉｍａｔｐｒｏｂｅＤＮＡＡｕＮＰｓｃｏｕｄｒｅｃｏｎｚｅＲＣＡｒｏｄｕｃｔｔｏｒｏｄｕｃｅｅｎｚｉｃ（）ｇｐｐｙｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｉｎａｌ．Ｕｎｄｅｒｏｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｔｈｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆｇｐ，ｓｎｔｈｅｔｉｃｔａｒｅｔＤＮＡｈａｄｏｏｄｌｉｎｅａｒｉｔｆｒｏｍ１０ａＭ化１０Ｍｗｉｔｈａｙｇｇｙｐ＝ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆ６．７６ａＭＳ／Ｎ３．Ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｅｄｍｅｔｈｏｄｈａｄｂｅｅｎ（）ｐ．ｉｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙａｌｉｅｄ！；〇ｄｅｔｅｃｔ又ａ／ｗｏｗｅ／／口ａｓｌｏｗａｓ６ＣＦＵｍＬｉｎｒｅａｌｐｐｍｉｌｋｓａｍｌｅ．Ｔｈｉｓｒｏｏｓｅｄｓｔｒａｔｅｓｈｏｗｅｄｒｅａｔｏｌ；ｅｎｔｉａｌｆｂｒｃｌｉｎｉｃａｌｐｐｐｇｙｇｐｄｉａｎｏｓｉｓｆｏｏｄｓａｆｅｔａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｍｏｎｉｔｏｒｉｎ．ｇ，ｙｇ２．乂ｎｅｗｍｏｄｅｆｉ＞ｒｈｉｈｌｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｅｃｉｆｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｂａｓｅｄｇｙｐ－ｏｎｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎａｓｓｉｓｔ；ｅｄｔａｒｅｔｒｅｃｙｃｌｉｎａｍｌｉｆｌｃａｇｇｐ村ｏｎａｎｄｍｉｓｍａｔｃｈｅｄｃａｔａｌｙｔｉｃｈａｉｒｉｎａｓｓｅｍｂｌｐｙＡｎｏｖｅｌｓｔｒａｔｅｇｙｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｆｏｒｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃ－ｄｅ１ｔｉＤｂｉＩｌｌｔｔ；ｅｃｏｎｏｆＮＡｙｃｏｍｂｉｎｎｇｅｘｏｎｕｄｅａｓｅａｓｓｉｓｂｄａｒｇｅｒｅｃｙｃｌｉｎｇａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈｍｉｓｍａｔｃｈｅｄｃａｔａｌｔｉｃｈａｉｒｉｎａｓｓｅｍｂｌ．Ｉｎｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｐｙｐｙ，ｔｈｅｔａｒｇｅｔＤＮＡｂｉｎｄｅｄｗｉｔｈＨＯ．Ｔｈｅｎ，ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩｃｏｕｌｄｃａｔａｌｙｚｅｔｈｅｓｔｅｐｗｉｓｅｒｅｍｏｖａｌｏｆｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｒｅｌｅａｓｉｎｇｔｈｅｔａｒｇ巧ＤＮＡａｎｄｔｈｅｏｕｔｐｕｔＤＮＡ．ＴｈｅｒｅｌｅａｓｅｄｔａｒｅｔＤＮＡｗａｓｆｒｅｅｔｏａｒｔｉｃｉａｔｅｉｎ出ｅｎｅｘｔｇｐｐｃｃｌｅｏｆｈｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｃｌｅａｖａｅｒｏｃｅｓｓＣｃｌｅＩ．ＴｈｅｏｕｔｕｔＤＮＡｙｙｇｐ（ｙ）ｐｃｏｕｌｄｂｉｎｄｗｉｔｈＨＩａｎｄｕｎｆｏｌｄｔｈｅｈａｉｒｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＨＩ．ＦｏｌｌｏｗｉｎＨ２ｐｇｈｂｒｉｄｉｚｅｄｗｉｔｈｔｈｅｏｅｎｅｄＨＩａｎｄ１化ｅｒａｔｅｄｔｈｅｏｕｔｕｔＤＮＡｗｈｉｃｈｙｐｐ，ｃａｅｄａ－ｕｓｎｅｗｃａｔａｌｙｔｉｃｈａｉｒｉｎａｓｓｅｍｂｌｙｃｉｒｃｕｉｔａｎｄｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＨ１Ｈ２ｐｃｏｍｌｅｘｅｓｃｌｅｎ．Ａｆｔｅｒｗａｒｄｓ化ｅｃａｔｕｒｅｒｏｂｅｓｉｍｍｏｂＵｉｚｅｄｏｎ化ｅｐ（Ｃｙ），ｐｐｅｅｃｏｄｅｃｏｕｓｅｃ－ｏｌｄｌｔｒｉｆｉｃａｈｒｉｄｚｅｗｉｅＨＩＨ２ｃｏｍｌｅｘｅｓ．Ｔｈｅｇｌｄｐｌｌｙｂｉｔｈｔｈｙｐ－－ｔ－ｓｒｅｔａｖｉｄｉｎａｌｋａｌｉｎｅｈｏｓｈａｔａｓｅｗａｓｌａｂｅｌｅｄｏｎｔｈｅｃａｔｕｒｅｒｏｂｅＨｌＨ２ｐｐｐｐｐｃｏｍｌｅｘｅｓｂｔｈｅｓｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｎｉｔｉｏｎｏｆａｖｉｄｉｎａｎｄｂｉｏｔｉｎｗｈｉｃｈｒｏｄｕｃｅｄｐｙｐｇ，ｐｅｎｚｍａｔｉｃｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｉｎａｌｒｅａｄｏｕｔ．Ｕｎｄｅｒｏｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｔｈｅｙｇｐ，５ 獻医科大学社研巧生学位论文ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆｓｙｎｔｈｅｔｉｃｔａｒｅｔＤＮＡｓｈｏｗｅｄｏｏｄｌｉｎｅａｒｉｔｆｒｏｍ１００ｇｇｙｆＭｔｏ５ｎＭｗｉｔｈａｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆ９２ｆＭ．ＴｈｅｄｅｖｅｌｏｅｄｍｅｔｈｏｄｈａｄｐｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌａｌｉｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔＤＮＡｉｎｔｏｔａｌＤＮＡｏｆｈｕｍａｎ打ｏｒｍａｌｙｐｐｃｅｌｌｓａｎｄｓｅｒｕｍｓａｍｌｅｓ．Ｔｈｉｓｓｔｏｔｅｍｉｇｈｔｂｅｃｏｍｅａｏｔｅｎｔｉａｌａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｐｇｙｐａｒｏ犯ｈ化ｒＤＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅａｒｅａｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｄｉａｎｏｓｉｓａｎｄ化ｅｒａｐｐｇｐｙ，ｐａｔｈｏｇｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｍｏ凸ｉｔｏｒｉｎｇｉｎｔｈｅ扣ｔｕｒｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．ＲｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＧｏｌｄｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩＣａｔａｌｔｉｃｈａｉｒｉｎｐ，ｐ，，ｙｐａｓｓｅｍｂｌｙ６ 戯医科大学社研触学位论文基于电化学ＤＮＡ生物传感器的核酸检测新方法研究第一章基于滚环矿増和金纳米技术实现沙ｎ氏苗快速和超灵敏检測的电化学新策略－本章内容发表于ＡｎａｌｔｉｃｓＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ２０１４８４６：４４５０ｙｊ，１引言一ｉ’ｔ３。沙口氏菌，革兰阴性肠道杆菌，是世界范围内最常见的食源性致病菌之Ｐ１沙口巧菌主要通过动物宿主。根据世界卫生组织、污染水或食物传播给人类（ＷＨＯ）报道，沙口巧菌每年可造成约７６万例食源性疾病，其中３２５，０００人次住４［］。院和５０００人死亡。因此，建立快速和高灵敏检测沙口氏菌的方法是极其必要的目前：，沙口氏菌的检测方法主要有Ｗ下几种传统的分离培养鉴定法、酶联６口］Ｌ］［免疫吸附法化ＩＳＡ）和聚合酶链反应（ＰＣ民）等。传统的培养方法首先将细菌进行分离培养，然后通过菌落计数和菌落形态、染色特征、生化反应等方法对７８’［１－Ｉ细菌进行鉴定，该方法可靠，但费时（４７天）耗力。ＥＬＳＡ法是基于抗原抗体特异性反应的免疫学检测方法，其主要缺点是：清洗过程复杂、分析策略费为和灵敏度不足Ｐ１。与ＥＬＩＳＡ法相比，ＰＣＲ技术具有快速、简单和较高的灵敏度等优势，但是其结果容易出现假阳性。目前实验室主要应用琼脂糖凝胶电泳技术对ＰＣＲＰＣＲ技术在实验室细扩增片段进行检测，由于该技术的分辨率较低，限制了’５ｉＷ＜１菌检测中的广泛运用（不足Ｗ检测１０ＣＦＵｍＬ浓度的细菌）。为了改善沙口氏菌的检测技术，新颖的传感方法被引入到实验研究中。电化学生物传感器因其’ｉｉｔＷ使用简便、响应快速、成本低和设备价格低廉等独特优势，能克服传统方法的局限性，将ＤＮＡ检测带入新时代。在过去几年中，各种放大方法被用于提高传感器的灵敏度。在己报道的方法一一ＤＮＡ中，滚环扩增（ＲＣＡ）是最流行的放大方法之。ＲＣＡ是种等温的扩增ｗｉ一’ｔ＾ｎ过程，能够在小时内扩増出包含上千互补于环状模板的串联重复序列ＲＣＡ７ 動医科大学祗±研巧生学位论文操作步骤简单快速，且对实验室条件没有特殊要求，因而比其他扩增技术更有潜ｗ－Ｗｔ质成为现有临床扩増方法的替代选择。迄今为止，ＲＣＡ已被广泛应用于诊断’１９２２ＤＮＡ［］基因组学和蛋白质组学领域中、ＲＮＡ和蛋白质的超灵敏检测。同时，多一种纳米材料已被用来进步提商传感器的灵敏度，其中Ｗ金纳米粒子（ＡｕＮＰｓ）的应用最为广泛ＡｕＮＰｓ具有巨大的比表面积、独時的物理化学性质、良好的ＰＭＳ１生物相容性和导电性等显著优点。一本文基于滚环扩増和金纳米探针双重放大技术，建立了种快速和超灵敏检一测沙口氏菌的新方法／？ｖ＾基因是－１上的。位于沙口巧菌致病岛种高度保守的致ｐｇｉ病基因。该基因能编码细茵侵袭蛋白，与沙口氏菌的毒力密切相关，因此可ＷＷ，３Ｗ作为沙口巧菌检测的潜在标志物。结合滚环扩增和金纳米探针双重放大技术，本研究能极大地提高沙口氏菌检测的灵敏度，为食源性疾病的预防和早期诊断提供强有为的工具。２实验巧分２．１村料和试剂ＤＮＡ寡聚核巧酸由生工生物工程技术服务有限公司合成和纯化（中国，上海）。－它们的序列样见表－ＮＰ、ＢＳＡ和娃鱼ＤＮＡ１．１。ＭＣＨ、ＳＴＡＰ、ａ精均购买自西格－ｈ奥德里奇公司ｉ２９ＤＮＡ玛（美国）。ＨＡｕＣｋ是从上海试剂公司购买。Ｐ聚合酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶和ｄＮＴＰｓ购自美国的Ｔｈｅｒｍｏ公司。ＰｒｅｍｉｘＴａｑＶｅｒｓｉｏｎ２．０，ＤＬ５００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ和琼脂糖均购自宝生物公司（中国大连）。其他所有试剂都是分析纯ＱＭ－级别１８Ｍ，Ｕｌｉ，Ｍｉｌｌｉｏｒｅ进行配制。。所有的水溶液均用超纯水（＾Ｑｐ）表Ｕ本实＆中合成的寒技普接々列Ｔｌｅ１ａｂ．１Ｓｅｑｕｅｎ化Ｓｏｆｔｈｅｕｓｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＇＇饼－ｉｇｏｎｕｄｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅ３巧）ＦｏｒｗａｒｄｒｉｍｅｒＧＣＡＴＣＣＧＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＣＣＧｐＲｅｖｅｒｓｅｒｉｍｅｒＴＴＣＴＣＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＧＣＣＣｐｅ－－Ｐｒｏｂ１ＳＨ（ＣＨ２ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＣＣＧＧＣＣＴＴＣＡＡＡＴＣＧＧＣＡＴＣ）６Ｐｒｏｂｅ２ＡＡＴＡＣＴＣＡＴＣＴＧＴＴＴＡＣＣＧＧＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＴＡＧＧＡＣＡＴＴａｒｇ巧ＡＴＧＣＣＣＧＧＴＡＡＡＣＡＧＡＴＧＡＣＴＡＴＴＧＡＴＧＣＣＧＶｎＴＧＡＡＧＧＣＣＧＧＴＡＴＴ８ 医科大学硕±研巧生学位论文－ｃｏｍＮｏｎｐｌｅｍｅｎｔａｒＡＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＡＡＴＡＧＡＡＴＴＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡｙＣＧＴＧＡＡ－ＣｉｒｃｌｅｔｅｍｌａｔｅＰＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＧＡＴＴＧＴＡＧＧＴＣＡＣＴＣｐＧＡＡＡＣＣＴＧＴＴＡＧＡＡＡＣＴＯｒＧＡＡＧＡＴＣＧＣＴＴＡ了ＴＡＴＧＴＣＣＴＡＴＣ－－Ｄｅ化ｃｔ－ｉｏｎ仍ｂｅＳＨＣＨＴＴＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＴＡＧＴＴＴＴＴＴＢｉｏｔｉｎ（）ｐ２６２．２仪器设备本实验的检测仪器是Ｃ扭６６０Ｄ电化学工作站（上海辰华仪器有限公司），其中的Ｈ个电极系统包括：钻丝电极为对电极，氯化银电极为参比电极，３ｍｍ的金电极为工作电极。ＡｕＮＰｓ紫外表征是用ＵＶ（２５５０）紫外分光光度汁（岛津）。ＡｕＮＰｓ（ＴＥＭ）Ｈ－７５００电镜表征采用的是透射电子显微镜（透射电子显微镜，日本），ＰＣ民ｃ－ｌｅｒｔｈｅｒｍａｌｃｃｌｅｒ（ＢｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）仪器上完成。凝胶电是在ＭｙＣｙｙｉ（Ｂ－ｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＵＳＡ）记录。泳的结果用成像仪，２．３觀米粗子和採针剛备（１）所有器皿用王水浸泡２４小时，之后用双蒸水洗净备用。（２）配制ｌＯＯｍＬ化０１％的ＨＡｕＣＬｔ４Ｈ２〇去离子水溶液，将其置于加热磁力ｉ４ｍＬＰｌ横拌器上攪拌，待溶液煮沸后快速加入ｌ％巧樣酸Ｈ纳溶液。ＡｕＮＰｓ溶液？，。继续揽拌８１０颜色首先变成黑色再逐渐变成酒红色分钟后，关闭热源并继’续攒拌冷却至室温，最后放入４Ｃ冰箱备用。（３）取９＾ｌＬ１００ｍＭ琉基标记的检测探针加入３００阵上述步骤２中配制的‘３２ＡｕＮＰ［１ｓ溶液中，在磁力揽拌器上４Ｃ揽拌１２小时。（４）在上述步骤３揽拌完的ＡｕＮＰｓ溶液中加入０．５ＭＮａＣｌ老化，揽拌１２小时。、（５）步驟４中的溶液停止攒拌后收集至离屯管，８０００ｒｐｍ离也３０分钟，去除上清液，所得的ＤＮＡ修饰的金纳米探针溶于２ＸＳＳＣ溶液（ｐＨ７．４，含有０．３Ｍ°氯化钢，０．０３Ｍ巧樣酸Ｈ钢）中放置于４Ｃ冰箱保存备用。２．４ＤＮＡ祥品的制备巧ＰＣＲ扩増反应２乂１细苗培养计巧９ ｇｇｇ医科大学肥研巧生学位论文‘（）７Ｃ恒温箱中培１将单个沙口氏菌菌落分区划线接种于血平板上，置于３？养１８２４小时。‘（２）从血平板上刮取单个细菌菌落，接种于ＬＢ液体培养基中，巧Ｃ持续振摇１６小时。（３）将培养后的细菌离也（１２０００转离也１０分钟）后，上清液用移液器吸，取弃去，用无菌超纯水洗涂２次后，再用无菌超纯水重悬。（４）取１０个ＥＰ管，分别加入９００咕的无菌超纯水溶液，将１００咕菌体重‘１悬液加入到各ＥＰ管中并吹吸３次，混匀，即成１０稀释液。－６－７４（５）用Ｈ角刮护分别将１００咕１〇，１〇，１０３个稀释度的菌液均匀涂抹在Ｈ个琼脂平板上？０，，将平板放置２３０分钟使菌液渗透于平板培养基中再倒置。’Ｃ恒温箱中培上的菌落数（６）将琼脂平板置于３７养２４小时，计数平板目。２．４２细苗基因组ＤＮＡ巧．取’３３００Ｃ水浴中解育［１将不同浓度的沙口氏菌置于１１５分钟，然后立即置于冰中、在４１：温度下＾＾１００００转离屯５，缓慢将上清液转移至新的￡口管中，即为，分钟后‘ＰＣＲ模ＤＮＡ－提取的可用作板的基因组，置于２０Ｃ保存。２．４．３ＰＣＲ扩増反应ＰＣ艮的最终反应体积为５０冲，包含：５．０沁的基因组ＤＮＡ、１．０阵的２０ｎＭｘ的正反向引物、２５ｉＬ的ＰｒｅｍｉｘＴａ（１．２５ＵＤＮＡ聚合酶，２Ｔａ缓冲液，０．４ｍＭ＾ｑｑ‘ｄＮＴＰｓ）和１８Ｌ的水ＰＣＲ：９５Ｃ条件下预变性３分ｎ。的反应条件如下首先是在‘’’钟，接着９５Ｃ变性３０秒，５１Ｃ退火３０轨７２Ｃ引物延伸３０秒，循环３５次，°最终７２Ｃ延伸４分钟，扩増的ＤＮＡ产物用２％的琼脂糖凝胶进行电泳，之后用成像仪显像。２．５环化横板的制备＇ｎ－ＤＮＡ００ｍｏ０ｎｍｏｌ２将１ｌ５端磯酸化的待环化模板与１０探针混合于１００阵连接缓冲液中（ｐＨ７．５，５０ｍＭＴｒｉｓ，ｌＯｍＭＭｇＣｂ，ｌＯｍＭ二硫苏糖醇，０．５ｍＭＡ’ＴＰ），再加入０．２Ｕ的Ｔ４ＤＮＡ连接酶，于３７ｒ连接反应６０分钟。然后在６５Ｃ’－１０分钟灭活Ｔ４ＤＮＡ连接酶，得到的ＤＮＡ环化模板在２０Ｃ下保存备用。１０ 旅医科大学硕±研巧生学位论文２乂电化学生巧传感器的制备（１）将裸金电极用０．０５Ｍｍ的铅紛处理、洗涂，然后浸入食人鱼溶液中１０、分钟，再取出清洗室温干燥。（２）将琉基标记的１００ｎＭ捕获探针滴加于上述电极上，置于４ｒ冰箱中过夜固定。（３）将步驟２中的金电极取出，冲洗，用ＭＣＨ封闭１小时，再次冲洗金电极，然后用娃鱼精ＤＮＡ和２％ＢＳＡ混合溶液封闭金电极３０分钟Ｗ避免非特异性４３３Ｐ’ＤＮＡ］和酶的吸附。’（４）ＰＣＲ产物置于１００Ｃ水浴加热变性５分钟，然后立即在冰上浑火３分钟Ｗ获得单链ＤＮＡ。合成的帮ＤＮＡ用ＳＳＣ稀释到所需的浓度。（５）将步骤３中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加待测範ＤＮＡ溶‘，ｒ液，巧Ｃ反应１小时，然后在金电极上滴加提前制备好的环化ＤＮＡ模板３７反应１小时。（６）将步骤５中的金电极取出冲洗，加入含ｄＮＴＰｓ和Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶的°３７滚环扩增反应液，Ｃ扩增Ｉ小时。（７）将步骤６中的金电极取出冲洗，加入用ＳＳＣ杂交液配制的金纳米探针，‘３７Ｃ杂交１小时，用ＤＥＡ缓冲液清洗电极。－°ｉｍＬ－（８）在步骤７中的电极上加入１．２５ｎｇ的ＳＴＡＰ，置于３７Ｃ反应３０分？＇－ＮＰ底钟，用ＤＥＡ缓冲液冲洗后，在化７５ｍｇｍＬ的ａ物溶液中进行示差脉冲伏安法（ＤＰＶ）信号检测。３结巧与讨论３．１电化学传巧器的设计原理原理图Ｕ阐述了沙口菌的传感检测过程。首先，範ＤＮＡ与电极上固定好的捕获ＤＮＡ特异性杂交。接着环化模板被加入到反应体系中形成Ｈ明治结构。在ｄＮＴＰｓ和ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶存在下，可滚环扩增产生微米级的包含上千互补于金纳米探针的串联重复序列的单链ＤＮＡ分子－ＡＰ与生物素化的金纳米检测。最后ＳＴ１１ 里庆医科大学硕±研巧生学位论文－探针结合，作用于底物（ＸＮＰ产生电化学信号，该电化学信号与视ＤＮＡ浓度成正比例关系一。此双重放大策略为沙口氏菌的超灵敏检测提供了个崭新的平台。－ＬＪ＿ｌ—ＩｊＰｒｏｂｅ１ｊｊｊ■尸ＴａｒｅｔＪ之’ｊ与ｊｇＰｒｏｂｅ２ｉｎｖＡｅｎｅ（ｇ）１．ＰＮ２９ＤＮＡ齒Ｉ飾ＳＰｈｏｌｍｅｒａｓｅ？ｏｔｎ参ＡｕＮＰｓｉ２９ＤＮＡｐｙ户ＳＴＡＰＢｉｉ困１．１电化学传感器检測沙口氏菌切以基因的原理Ｆｉ１１Ｓｃｈｅｍａｉｃｒｅｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｄｅｓｉｎｅｄｓｒａｆｏｒ／／７Ｖ４ｄｅｃｔｉｏｎｏｆ５Ｖ／／ｗ０ｗｅ／／ａｇ．．ｔｐｇｔ化ｇｙ／化３．２金纳米粒子和金纳米探针的表征ＡＮＰ一为了验证制备的ｕｓ的直径大小、均性Ｗ及金纳米探针是否修饰成功，本研究采用ＴＥＭ和紫外可见吸收光谱分别验证ＡｕＮＰｓ和标记的纳米探针。ＡｕＮＰｓ一１２，合成的电镜表征如图．Ａ所示。采用上述方法制备的ＡｕＮＰｓ大小均直径约为１８ｎｍ左右。图１．２Ｂ为紫外可见吸收光谱表征图。如图所示，曲线ａ为制备的ＡｕＮＰｓ，５２０ｎｍ处有明显的吸收峰，其溶液为红色的紫外可见吸收光谱图在波长为：曲线ｂ为修饰有ＤＮＡ的ＡｕＮＰｓ在加入０．１ＭＮａＣＩ后的紫外可见吸收光谱图，在５２０ｎｍ有明显的吸收峰。因为修饰有ＤＮＡ的ＡｕＮＰｓ可Ｗ在高盐离子溶液中稳定存在，其溶液依然为红色；曲线Ｃ是未修饰ＤＮＡ的ＡｕＮＰｓ在加入化１ＭＮａＣＩ后的紫外可见吸收光谱图，在５２０ｎｍ几乎没有吸收峰，且其溶液迅速变为黑色，由此可见未经修饰的ＡｕＮＰｓ在加入高盐离子溶液后会形成聚集现象。１２ 重庆医科大学硕王研宛生学位论文—？ＢＡ厂？ＩＩ？－朱ｂＣ！？０．２？扩？挺？Ｉ？％Ｊ４００５００６００、、ａ＇ｏｉｃｎｇｉｈ（ｎｍ）图１．２（Ａ）ＡｕＮＰｓ的逢射电化表征；（Ｂ）紫外可见吸收光谱表征；（ａ）ＡｕＮＰｓ；（ｂ）加入０．１ＭＮａＣＩ溶液的修饰有ＤＮＡ的ＡｕＮＰｓ；（ｃ）加入０．１ＭＮａＣＩ溶液的ＡｕＮＰｓＦ２ＡＴＥＭ－ｉＡＮＰＢＵＶＶｉｓａｂｏｔｉｏｎＳｅｃｔｒａａＡＮＰｂｈｉ．１．ｍａｅｏｆｕｓ．ｓｒｏｆｕｓＡｕＮＰｓｗＨｇ（）ｇ（）ｐｐ（），（）ＳＨ－ＤＮＡ－ａｆｔｅｒａ加Ｗｏｎｏｆ０．５ＩＶｌＮａＣＵｃＡｕＮＰｓｗｉｔｈｏｕｔＳＨＤＮＡａｆｔｅｒａ加ｉｔｉｏｎｏｆ０．５Ｍ（）ＮａＣＩ３３传感器的电化学表征一本实验用电化学阻抗法（ＥＩＳ）和方波伏安法（ＳＷＶ）来验证电极毎步的修３－ｗ－饰情况，ＦｅＣＮ６被用作氧化还原电位测试探针，。在ＥＩＳ中阻抗图谱可用来［（）］一计算电荷转移阻力（Ｒｅｔ）。如图１．３Ａ，裸金电极（曲线ａ）阻抗几乎呈条直线，这说明处理后的裸金电极有良好的电子传导性。当捕获探针自组装到金电极上后，Ｒｅｔ得到增加（曲线ｂ）。这是由于单链核巧酸带负电荷的礎酸盐骨架阻碍了电子在－－３／４电极和Ｆｅ（ＣＮ）６溶液中的转移。当範ＤＮＡ与捕获探针杂交后，金电极上负电荷一的增加导致民ｅｔ进步增加（曲线Ｃ）。而当ＲＣＡ完成后，Ｒｅｔ得到更为显著的增加（曲线ｄ），这也证明了ＲＣＡ的成功完成。最后，加入金纳米检测探针与ＲＣＡ产物结合后，Ｒｅｔ明盈降低（曲线ｅ）。此现象归因于纳米材料具有较大的比表面积，结果如图１３Ｂ和能加速电子传递。同时我们也用ＳＷＶ进巧了传感器的表征．所一一示，ＳＷＶ与ＥＩＳ的结果呈现出良好的致性，这证明本实验的每步都得到了准确的修饰。１３ 重庆医科大学硕：生学位论文２〇ｔＩ１１－６０１ＡＢ八养謹０！２‘、４．０００．０．２４＇Ｚ（Ｋｎ）ＫＶ（）困．３Ｓ（Ａ）和ＳＷＶ（Ｂ）：ａ）ｂ）１在铁氣化舒溶化中电板的表征巧Ｏ裸金电板；捕获探针修饰后的电板；Ｃ）电化学传惠器与耗ＤＮＡ杂交后；ｄ）ＲＣＡ后；ｅ）与金纳米捡測探针反应３－Ｍ４Ｆｉ１３凹ＳＳＷＶｉ０４ＭＫＣＩｉｉｎＦｂａｌ．．Ａａｎｄｎ．ｃｏｎｔａｎ０．５ｍｅＣＮａｔａｒｅｅｅｃｔｒｏｄｅｇ（）（巧ｇ（）６），ｂｃａｔｕｒｅＤＮＡｍｏｄｉｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅ，ｃｃａｔｕｒｅＤＮＡｍｏｄｉｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅａｆｔｅｒｈｂｒｉｄｉｚｅｄｗｉｔｈ））ｐｐｙｔ－ｔ：ａｒｅＤＮＡｄａｆｔｅｒＲＣＡａｎｄｅ扣ｒｔｈｅｒｒｅａｃｉｏｎ、ｖＵｈＤＮＡＡｕＮＰｓｇｔ，））３．４传感活的放大效能本方案中，ＡｕＮＰｓ具有重要的放大作用。１００ｆＭ的铅ＤＮＡ在有民ＣＡ和ＡｕＮＰｓ存在时比仅有ＲＣＡ的ＤＰＶ信号大得多。这是因为ＡｕＮＰｓ具有较大的比表面积，能很好的辅助电子转移（图１４）。因此，建立的生物传感平台能够特．异和超灵敏的测定靴ＤＮＡ。＊１２１１ＲＣＡ＋ＡｕＮＰｓｉ…■Ｊ＿＿■圓口—困１．４１００ｆＭ的把ＤＮＡ在有ＲＣＡ和ＡｕＮＰｓ和有ＲＣＡ无ＡｕＮＰｓ与空白对照的ＤＰＶ信号对比枉状图Ｆｉ１．４ｍａｒｉｓｏｎｏｆＤＰＶｅａｋｃｕｒｒｅｎｓｉｎｈｅａｂｓｅｎｃｅｂｌａｎｋ化ｅｒｅｎｃｅｆ１００（Ｍｇ－Ｃｏｐｐｔｔ（）ａｎｄｐｓｅｏ＊－化ｉｇｅｔｗＵｈＲＣＡｗＵｈｏｕｔＡｕＮＰｓａｎｄＲＣＡＡｕＮＰｓ（）１４ 科大淵壬研巧生学位论文３．５实验条件的优化为了获得最佳的分析性能，对实验条件进行了优化。作为民ＣＡ启动子的环化模板浓度对传感器的性能有极大的影响。因此，环化模板的浓度最先被优化。随一着环化模板浓度的増加，ＤＰＶ响应值也逐步增加，在２０ｎＭ时趋近于个恒定值，因此该浓度被选作环化模板的最优浓度（图１．５Ａ）。民ＣＡ的时间同样也是一个重要参数本实验的。当环化模板的浓度为２０ｎＭ时，ＲＣＡ信号随着时间的增加而逐步增加，在６０分钟时趋近最大值。６０分钟被选为ＲＣＡ的－最优时间（图１．５Ｂ）。如图１．５Ｃ所示，底物ａＮＰ的ＤＰＶ信号在－ｉ之前增加迅速－ｍＬ，而后电化学信号达到平台，因此本实验ａＮＰ的最优浓度为＇０＇．７５ｍｇｍＬ〇￣￣＂■ｉＩ１Ｉ！ＩＴ＾Ｚ一＂＇ＡＢＣ？厂Ｉ；＾广。．＂「＂．ｆ７／■－．Ｉ＂Ｌ，ｒ１Ｉ１１０ＩＩ２０说《５１ＭＷ２Ｓ＃ＭＭ１Ｍ１．４ＯＪＵ＊Ｃ＇ＭｃｃｉｔｎｔｉＭ（ｉＭ）ＴｉａｃｎｉＲ）ＣｎｅｏｒｔｒｉｔｉＭ＾ＭｎｉＬ｝（（１－．５■环化模板浓度ＮＰ浓困实Ａ条件的优化：Ａ；瓦ＲＣＡ时间；Ｃ．底我ａ度Ｆｉｇ．１．５ＤｅｐｅｎｄｅｎｃｅｓｏｆＤＰＶｐｅａｋｃｕｒｒｅｎｔｓｏｎｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｍｉｘｔｕｒｅｃｏｎｃｅｉＵｒａｔｉｏｎ（Ａ），ＲＣＡ化３－（：１；〇１１ｔｉｍｅ（Ｂ）（ｉＮＰｃｏｎｃｅｎ化ａｔｉｏｎＣｗｈｅｎｏｎｅｔｉｌｔｈｅ，（），ｐａｒａｍｅｅｒｃｈａｎｇｅｓｗｈｅｏｔｈｅｒｓａｒｅｕｎｄｅｒｔｈｅｉｒｏｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｉｏｎｓｐｔ３．６传感器的分析性能３．６．１传巧器的巧巧性在最优的实验条件下，ＤＰＶ峰电流随着合成的祀ＤＮＡ浓度的不同而产生的变化见图１．６。由围所示，ＤＰＶ响应信号随着祀ＤＮＡ浓度的增大而增大。图１．６的插图展现了在ＩＥＤＮＡ浓度为，ｌＯａＭ到ｌＯｐＭ范围内ＤＰＶ响应信号与範ＤＮＡ浓＝／＞＜度呈现良好的线性关系。相应的回巧方程是ｌＡ０．７２＋０．１４ｌｃｆＭ，相关系（＾）ｇ（）数为化９９７２，最低检测限为６．７６ａＭ，远低于之前报导的其他检测沙口氏菌的方法５１ 重庆医科大学巧±研充生学位论文Ｐ’Ｗ（表１．２）。本传感器的超高灵敏度主要归因于ＲＣＡ和金纳米探针的双重放大作用。０．．１０２０．３Ｅ（Ｖ）图．６电化学传感器检测００．０１０１１１００１０１，，．，，，００和１００００１＾耗〇？乂的〇口￥图插图：〇户￥，峰电流与於ＤＮＡ浓度对数的校准曲线Ｆ＊ｉ．１．６ＤＰＶｒｅｓｏｎｓｅ０００化ｇｐｔｏ．１１１１００１０００１００００ｆＩＶＨａｉｅｔＤＮＡｆ，，，，ｒｏｍａ化．Ｉｎｓｅｔ：，，ｇ（ｇ）ＣａＨｂｒａｔｉｏｎｐｌｏｔｏｆＤＰＶｐｅａｋｃｕｒｒｅｎｔｖｓｌｏｇａｒｉ化ｍｏｆｔａｒｇｅｔＤＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ－Ｔｈｅｅｒｒｏｒｂａｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｅａｃｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ３．６．２传巧强的特异性和重现性为了研究传感器对不同ＤＮＡ序列的特异性，１７，ＤＮＡ如图．所示用传感器分别检测１００ｆＭ和１０ｐＭ的两种不同的寡核昔酸（完全互补的寡核昔酸和非完全互补的寡核昔酸）。完全互补的寡核巧酸的ＤＰＶ响应值远大于非完全互补的寡核昔酸和空白的响应值。此结果表明，本分析方法能有效地区分不同的ＤＮＡ序列，表现出很好的选择性。为了评价传感器的重复性，ＩｐＭ的合成视ＤＮＡ被检测了５次，相对标准差（ＲＳＤ）小于５％，这表明本方法有可接受的再现性。１６ 重庆医科大学硕壬研巧生学位论文－１６—１＾Ｃｏｍｐｌａｆｎｅｎｔ＾￣£〇ｍｔＮｏｎ）【ｅｍｅｎ（■ＨＢｌａｎｋ旺ｌＯｐＭｌＯＯｆＭ困１．７电化学传感器检測把板每酸序列、非完全互补的寡板普酸序列和空白对照的ＤＰＶ响应枉状困，各孩背酸的浓度分别为ｌＯＯｆＭ和ｌＯｐＭＦｉｇ．１．７ＣｏｍｐａｉｉｓｏｎｏｆＤＰＶｐｅａｋｃｕｒｒｅｎｔｓａｆｔｅｒｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｋｈ１０ｐＭａｎｄ１００ｆＭｏｆａｒｅｔｏｏｎｕｃｔ－ｔｇｌｉｌｅｏｉｄｅｓｎｏｎｃｏｍｌｅｍｅｎｔａｒｏｌｉｏｎｕｃｉｅｏｔｉｄｅｓａｎｄｂｌａｎｋｇ，ｐｙｇ３．７实际样本中沙口巧茜的检測为了评价研制的生物传感器在实际样本检测中的分析性能，培养的沙口氏菌８ｉ，０６ｘ被接种到牛奶中浓度从到ｌ〇ＣＦＵｍＩ；。将牛奶样品经过预处理后，对每个浓度沙口氏菌所提取的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ。扩增出的ＰＣＲ产物为７５ｂｐＤＮＡ条带，琼脂糖凝胶电泳显像后如图１８．Ａ所示。由于漠化乙锭（ＥｔＢｒ）对于单链ＤＮＡ－５ｉ的染色效率很低，所Ｗ凝胶电泳不能有效的鉴定低于６ｘＣＦｌ〇ＵｍＬ的沙口氏菌的ＰＣ民扩增产物，。同时本文建立的电化学ＤＮＡ传感器也被用于分析沙口氏菌８ｉ的变性ＰＣＲ产物（０到６ｘｌ〇ＣＦＵｍＬ；）。不同浓度的沙口氏菌的电化学响应值５－ｉ１８Ｂ１．８Ｂｘ见图．。图的插图展现了在沙口氏菌浓度为６到６ｌ〇ＣＦＵｍＬ范围内，ＤＰＶ响应信号与沙口氏菌浓度呈现良好的线性关系，相关系数为化９９８９。本研巧－建立的传感策略能识别实际牛奶样品中低于ｉ６ＣＦＵｍＬ的沙口民菌，这比之前报３４－３８，道的其他沙口氏菌的检测方法要低得多Ｗ］（表１．２）。为了验证该传感器在实际样本中的特异性，对四种不同细菌的ＰＣＲ产物进行了检测。该四种细菌分别为沙口氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌。如图１．８Ｃ所示，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的电化学响应信号与空１７ 置庆医科大学棵±研巧生学位论文白响应信号相近，且明思小于沙鬥氏菌的电化学响应信号。这些结果说明本传感器具有很好的特异性。传感器的高灵敏度和高特异性能推动其在实际中的应用。０ｌｉ，｜ＩＩ：ｉａｂｃｄｅｆｇｈｉ阳ａｎｋａｂｃｄｅ８－Ａｘｉ田１．８（）０到６ｌ〇ＣＦＵｍＬ沙口氏苗的ＰＣＲＢ产Ａ的电沐巧；（）电化学传患巧检测的８－１ｘ巧号柱化巧插困：ＤＰＶ峰电洗与沙口氏巧浓度对數的枝准曲巧：（Ｃ）６ｌ〇ｃＦＵｍＬ的沙，口氏巧（ａ、大巧押苗ｂ、金黄Ｃ、ｄ来空白对照（ｅ（）色葡巧球巧（）肺炎链球菌（））＊Ｆｉ．１．８ＡＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓｈｏｔｏｓｏｆ５００ｓｉｚｅｍａｋｅｒＭａｎｄＰＣＲｒｏｄｕｃｏｆ６ｘ１０ｇ（）ｐｐ咕，ｔｓ（）ｐ，．７６５４＇２ｘｘｘｘｘｉｉａ６ｘｌ〇ｂ６ｌ〇ｃ６ｌ〇ｄ６ｌ〇ｅ６ｘｌ０ｆ６１〇６ｌ〇ｈｉＣＦＵｍＬ（，，），（，，６ｏｆ）（）（（），），（）化）（），（）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．ＢＤＰＶａｋｃｕｒｒｅｎｔｓｒｅｓｎｄｉｎｔｏＰＣＲｒｏｄｕｃｔｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｓｅｒｉａｌｄｉｌｕｔｉｏｎｓ（）ｐｅｐｏｇｐ８－ｘｉｏｆＳａｌｍ饥ｅｌｌａｉｎ也ｅｒａｎｇｅｏｆＯｔｏ６１〇ｃｐｕｍＬ．ＩｎｓｅｔＰｌｏｔｏｆＤＰＶｐｅａｋｃｕｒｒｅｎｔｖｓｌｏｇａｒｋｈｍｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏａ（Ｃ）ＤＰＶｐｅａｋｃｕｒｒｅｎｔｓｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ化ＰＣＲｐｒｏ化ｃｔｓｏｆ＊＇ｘｍＬ＊６１０ＣＦＵｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａａＥ．ｃｏｌｉｂ，ｓｔａｈｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｃＳｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ（），（）ｐｙ（）．ｐａｅｕｍｏｎｉａｅｄａｎｄｂｌａｎｋｅｐ（）（）１８ 館區科大学社研巧生学俭论文表１．２本方法与其他色报道的沙口氏巧拴測方法的对化Ｉｋｂｌｅ１，２Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｐｒｏｐｏｓｅｄｍｅｔｉｉｏｄａｎｄｏｔｈｅｒ巧ｐｏｒｔｅｄｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓｆｏｒ化化ｃｔｋｍ彷ｆｅ化Ｉ＇＇＊＾Ｂｉｏｓｅｎｓ肿ＰｌａｔｆｏｒｍＢｉｏ－ｒｅｃｅｔｏｒｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎＬＸ）ＤＬＬＯＤＣＦＵｍＬＲｅｆ．ｐ（）（）ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＯｌｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ３ｆＭ３０２ｇ［］２ＳＰＯｌｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ０．５ｎＭｌ〇１０民ｇ［］＾－Ｍｎｔｏｔ＞＜ｅｅｌａｓｉｃＥ２ｈａｇｅ５１０［３４巧ｐ］３—－ＡＦｌ〇化ｅｒＯｐｔｉｃｎｔ化ｏｄｙ［３５］］Ｅ—ＳＭＯｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｎｔ化ｏｄｙ［１习ｃｈｒｏ打０ａｎｅｒｏｍｅｔｆ）（＾ｙ］－巨ｌｅｃｔｒｉｃａｌｉｍｅｄａｎｃｅＡｎｔｉｂｏｃｆｙｌＯ３６ｐ［］－－ＳｃｒｅｅｎｐｒｉｎｔｅｄｃａｒｂｏｎＡｎｔｉｂｏｄ１４３［１３ｙ］ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ＊ＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＰＶ）Ｏｌｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ６．７６ａＭ６Ｔｈｉｓ（ｇｓｕｄｔｙ４小结一结合滚环扩增和金纳米探针技术，本文建立了种超灵敏和快速检测沙ｎ氏菌的新方法。该放大策略能极大的提高祀ＤＮＡ检测的灵敏度至６．７６ａＭ。同时本方法已成功用于沙口氏菌变性ＰＣＲ产物的检测，能识别实际牛奶样品中低于６－ＣＦＵｍＬｉ的沙口氏菌，本文建立的策略能为临床诊断、食品安全、生物威。因此一个简单胁和环境监测等领域病原菌的检测提供、低成本、通用和强有力的工具。１９ 店科大学巧女研巧生学位论文参考女献＊ｔＩＰｅｎＨＳｈｅｌｅｆＬＡ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｅｃｔｉｏｎｏｆｌｏｗｌｅｖｅｌｓｏｆ化似切６［］ｇ，Ｉ－ａｎｄＳ幻／／ｗｏｒｔｃ／／幻ｅｉｎ技ｏｄｓＪ．ｎｔ．Ｊ．ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１６３３：２２５２．［］，，）３３（巧ＷａｎｇＺｔＸｕＨ，ＷｕＪ，ｅｔａｌ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ沉ｆ／／ｗｏ打ｅ化ｒｗｉｔｈｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｔｔＦｏｏｄ－ｂ１１１２５７７９ｉｏｃｏｎｕａｅｄｎａｎｏａｒｉｃｌｅｓｒｏｂｅ．Ｃｈｅｍ．２０：７８４．ｊｇｐｐ阴，，口）ｓｅ－ｂａｓｅｄｍｅｈｏｄｆｏｒ－３ＯｌｎＪＥ．ＤＮＡｔｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ仿ｏｄｂｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉａｌａｔｈｏｅｎｓＪ．［］ｐｇ［］Ｆｏｏｄ－－Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．２０００３３３４：２５７２６６．，，（）４ＷＨＯＦｏｏｄＳａｆｅｔｙａｎｄＦｏｏｄｂｏｍｅＩｌｌｎｅｓｓ巧Ｂ／ＯＬ．２０１１［］，］，ｈｔ巧：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ＭｅｄｉａＣｅｎｔｒｅ／拉ｃｔｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ２３７／ｅｎ／．５ＳｄｉｎｅｉｄＡＤＲｏｄｒｉｕｅｓＫＩ＾ＣｈｅｍｅｌｌｏＤｅｔａｌ．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆａｎｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡ］，ｇ，［，＊说如幻位！ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ２〇巧６／／ｉｎｃｈｆｃｋｅｎｍｅａｔｖＢｒａｚ＊Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６，３７：［叮，－％５３５０．－ｅｎｃｌ６ＣｉａｒｉｎｉＢｏｒｄｅＣＣｏｕｒｔｏｉｓＳＬａＳｃｏａＢ．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓａｓｖｉａｂｉｌｉｔｍａｒｋｅｒｓｆｏｒ，［］，ｙ－ｂａｃｔｅｒｉａｄｅｔｅｃｔｉｉｏｎｕｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｏｏｌｓＪ．ＦｕｔｕｒｅＭｉｃｒｏｂｏｌ．２００９：４６４．ｇ［］，，）５７ＴｒｋｏｖＭ，ＡｖｕｇｔｉｎＧＡｎｉｍｒｏｖｅｄ１６ＳｒＲＮＡｂａｓｅｄＰＣ民ｍｅｔｈｏｄｆｂｒｔｈｅｓｅｃｉｆｉｃ［］ｇｐｐ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉ２００３ｏｆＳａ／ｚｗｏｗｅ／／口ｅｎｔｅｒｉｃａ．Ｉｎｔ．Ｊ．ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｏｌ．８〇：７５．［Ｊ，６７］，ｙ）間ＲｏｄａＡ，ＭｉｒａｓｏｌｉＭ，ＲｏｄａＢ，ｅｔａｌ．Ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎｒａｐｉｄｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｂｂａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｆｂｒｆｏｏｄｂｏｒｎｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｂａｃｔｅｒｉａｄｅｔｅｃｔｉｏｎ口］？Ｍｉｃｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ－－２０１２１７８１２：７２８．，，（）ｒｉｓｈｎａｍｏｏｒｔｈＫＧｏｋｈａｅＣｏｎｔｒａｃｔｏｒＡＮｏｖ＂ｌ民Ｓｅｔａｌ．ｅｌｌａｂｅｌｆｒｅｅＤＮＡ口］Ｋｙ，，Ｑ，－ｓｅｎｓｏｒｓｂａｓｅｄｏｎｏｌ３，４ｅ化ｌｅｎｅｄｉｏｘｔｈｉｏｈｅｎｅＣｈｅ肌Ｃｏｍｍｉｉｎ．２００４，７：（）［化，ｐｙｙｙｐ－８２０８２１．ＺｈａｎａｎＹＲＬ－－１０ＤＣｉｅｔａｌ．Ｌａｂｅｌｆｒｅｅａｎｄｈｉｈｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｆ］，Ｙ，ｏｎｏ，Ｑ［ｇｇＳａｕｓａｓｕｒｃｅａｓｍｏｎｒｅｏｎａｎｃｅ－ｓｓｅｎｓＪｌｍｏｎｅｌｌａｉｎｇ色ｐｌｓＤＮＡｂａｅｄｂｉｏｏｒ［Ｊ］．．ｔ－－Ｂｂｅｃｈｎｏｌ．２０１２１６０４：１２３１２８．，，口）ＩＩＬｉｅｂａｎａＳＬｅｒｍｏＡＣａｎｒ）〇ＳｅｔａＬＭａｎｅｔｏｉｎｕｎｕｎｏｓｅａｒａｔｉｏｎｏｆａｔｈｏｅｎｉｃ［］，，ｙ，ｐ５ｇｐｇｂａｃｔｅｒａａｎｄｅｃｔｒｏｃｈｅｍｃａｍａｔｏｅｎｏｅｎｓｎｏｆｅｏｕｂｅ－ｔａｅｄａｍｃｏｎｉｌｅｉｌｇｎｅｇｓｉｇ化ｄｌｇｇｐｌｉ２００９８－Ｊ．ｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１１４；５８１２５８２０．［］Ａ，，（）［１２］ＳａｌａｍＦ，Ｔｏ化ｉｌｌＩＥ．ＤｅｌｅｔｉｏｎｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍｕｓｉｎｇａｎ２０ 庶医科大学巧古研她学位论文ｅＢ２００９－ｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒＪ．Ｂｉｏｓｅｎｓ．ｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２４：２６３０２６３６．［］，，巧）１ｎｓｏＡＳ－ＬＢｒａ艮Ｃｅｔａ３Ａ仿Ｐ红ｅｚ６ｐｅｚＦａｉｌｅｃｔｒｏｃｔｅｃｔｏｎｏｆｌ．Ｅｈｅｍｉｃａｌｄｅｉ［］，，，ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｕｓｉｎｇｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓＵ］．Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１３４０１：，，（）－１２１１２６．１４ＦｉｒｅＡＸｕＳ．ＲｏｌｌｉｎｒｅｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｈｏｒｔＤＮＡｃｉｒｃｌｅｓＪ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ［］，ｇＱｐ［］－Ｕ．．Ｓ．Ａ１９９５９２１０：４６４１４６４５．，，（）１５ＳｃｈｗｅｉｔｚｅｒＢＲｏｂｅｒｔｓＳＧｒｉｍｗａｄｅＢ，ｅｔａｌ．Ｍｕｌｔｉｌｅｘｅｄｒｏ化ｉｎｒｏｆｉｌｉｎｏｎ［］，，ｐｐｐｇｓｂｒｏ－ｔＮａｔ良ｔ２００２２０ｍｉｃｒｏａｒｒａｌｌｉｎｃｉｒｃｌｅａｎｌｉｆｉｃａｋ）打？ｉｏｅｃｈｎｏｌ．４：ｙｙｇｐ［叮，，（）－％５３巧．ｔ［１６］ＭｕｒａｋａｍｉＴＳｕｍａｏｋａＪＫｏｍｉａｍａＭ．Ｓｅｎｓｉｉｖｅｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ，，ｙｎｕｃｅｃ－ａｃｓｅｕｅｎｃｅｒｍｅｒｅｎｅｒａｔｏｎ－ｒｏｃｒｃｅａｍｉｃａｔ）打ＮｕｃｅｃｌｉｉｄｑｂｙｐｉｇｉＵｉｎｇｉｌｐｌｉｆｋ町ｌｉＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２００９，巧（３）：ｅｌ９．１７ＬｉＪＳＤｅｎＣｈｕＸｅｔａｌ．Ｒｏｌｌｉｎｃｉｒｃｌｅａｒｊｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｏｌｄ［］，ｇＴ，，ｇｕｇｎａｎｏａｒ－ｔｃａｒｅａｔｅｓｆｏｒｌｓｅｎｓｔｉｖｅｉｄｅ打ｔｆｉｃ汹ｎｕｃｅｏｔｉｄｅｐｉｆｅｇｇｇｈｉｇｈｙｉｉｋｍｏｆｓｉｎｇｌｅｌＡ１０８２７－ｏ：２１１１ｌｍｏｒｈｉｓｍｓＪ．ｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０８２８６．ｐｙ，，（）ｐ［］［１８］ＺｈｏｕＸＭ，ＳｕＱ，ＸｉｎｇＤ．Ａｎｅｆｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔａｓｓａｙｆｏｒｈｉｇｈ化ｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｅｒｃｕｒｙＩＩ）ｂａｓｅｄｏｎｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｒｏｌｌｉｎｃｉｒｃｕｌａｒａｎｒｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＪ．（ｇ＾［］２０－ＡｎａＬＣｈｉｍ．Ａｃｔａ１２７１３：４５４９．，，ＳＪｔＩｔＤＮＡｌＳｃｈｗｅｉｔｚｅｒＢＷｉｌｔｓｈｉｒｅＬａｍｂｅｒｔｅａｌ．ｍｍｕｎｏａｓｓａｓｗｉｈｒｏｌｌｉｎｃｉｒｃｌｅ＾，［，，ｙｇ过ｎｌｔｔｐｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ａｖｅｒｓａｉｌｅｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｕｋｒａｓｅｎｓｈｉｖｅ泣打ｉｇｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎＪ．Ｐｒｏｃ．［］＇ＮｔＬｃ－ａＡｃａｄ．Ｓｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０００９７１８：１０１１３１０１１９．，，（）口０］Ｃｈｅ打ｇＷ，ＹａｎＦ，ＤｉｎｇＬ，ｅｔ过１．Ｃａｓｃａｄｅｓｉｇｎａｌａｎｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｓｕｂａｔｏｍｏｌａｒｒｏ化ｉｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂｒｏｌｌｉｎｃｉｒｃｌｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｕａｎｔｕｍｄｏｔｓｐｙｇｐｑＪＡ２０１０－ｔａｉｎ．ｎａＬＣｈｅｒａ８２８：３３３７３３４２．ｇｇｇ［］，，（）－ｍ２１Ｂｉｕｍｂｂｅｒｏｔｅｃａａｄｅｏｔｈｍｔｏｎ：ｉＳＣｕｉＹＹＬＬＤｌｌｂｅｅｄｉａｄｓｃｉｓｅｒｍａｌａｌｉｆｉｃａｉＡ［］，，ｐｐｎｏｖｅ－ｌｓｔｒａｔｅｆｂｒｅｌｆｒｅｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｓａｎｄａｌｉｃａｔｏｎ化ｒｅａｇｙｌａｂｉ校ｐｐｉｌｍ－ｓａｎ）ｅａｓｓａＡｎａＬＡｃｔａ２０：７４：５ｌｙ［Ｊ］，Ｃｈｉ．，１３７６０６９．，２ｕａｎｇ１＾ＪＪｈｅｎｅｔａＬ民ｏｉｌｉｎｃｈａｉｎａｍＵｆｉｃａｉｏｎｂａｓｅｄｓｉｎａ＾ｅｎｈａｎｃｅｄＷｕ，ＺｇＬｇｔｇ［句Ｈ，ｐｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌａｐｔａｓｅｎｓｏｒ仿ｒｕｋｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏ打ｏｆｏｃｈｒａｔｏｘｉｎＡＰ］．ＡｎａＬＣｈｅ肌２０１０－９１３８５２２：８４２１０８４．，，（）２１ 运科大蜘丈研尴学位论文［２３］ＣｈｅｎｇＷ，ＣｈｅｎＹＬ，ＹａｎＦ，ｅｔａｌ．Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｓｃａｎｏｍｅｔｒｉｃｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｏｒｏ－ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｔｅｎａｓｅｓｕｓｎａｔｎｅｔａｅｄｅｔｅＡｕｎａｎｏａｒｔｃｅｒｏｌｌｉｉｇｈｉｓｉｄｉｉｄｉｌｂｅｐｇｇｐｐｐｐＣ４７１－？ｈｅｒａＣｏｍｍｕｎ．２０１１０：２８７７２８７９．阴，，（）［２４ＸｕＪ，Ｊｉａｎ目Ｙ，ＳｕＪ，ｅｔａＬＢａｃｋｒｏｕｎｄｃｕｒｒｅｎｔｒｅｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｂａｒｃｏｄｅ］ｇｇ－ｌｅａｎｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｌａｂｅｌｆｒｅｅｈｉｈｌｓｅｎｓｔｉｖｅｅｌｅｃｔｒｏｃｔｉｏｎｏｐ，ｇｙｉｈｅｍｉｃａｌｄｅｆｔｃＤＪｍｍｕｎ２０１２４２７－ａｈｏｇｅｎ：；３０９３３１ｉＮＡ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．８３１．ｐ［］，），（２５ＣａｉＳＳｕｎＹＨＬａｕＣｅｔａｌ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｔａｓｅｎｓｏｒｂａｓｅｄ，［，，］ｐ－ａ巧ｓｔｅｄｒｅｃａｍｔｎａＡｔｏｎｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｃｌｉｎｌｉｆｉｃａｉｏｎ．ＡｌＣｈｉｍ．ｃａ２０１３１：ｇｐｙ］，７６ｙ，－１３７１４２．２６－ｉａｏＦ乂ＬｉｕＪＬｉＦｅｔａＬＡｎｔｉｂｏｄａｎｄＤＮＡｄｕａｌｌａｂｅｌｅｄｏｌｄｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓ：［］Ｑ，ｙｇｐｓｔａｂａｎｄｒｅａｃｔｖＡＳｃ２００８－１：９４１２９４６ｉｌｉｔｙｉｉｔｙＪ．ｐｐＬＳｕｒｆ．Ｌ，２５４（０２．［］，）ＰｅｎＪＦｅｎＫｅ－２７ｇＮｈａｎｔａｔＣａｌｃｈｉｍｃａｒｂｏｎａｔｅｏｌｄｎａｎｏｃｌｕ巧ｅｒｈｂｒｉｄ［］，ｇＬＺｇ，，ｇｙｓｈｅｒｅｓ－：ｓｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｖｅｒｓａｔｉｌｅａｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ？ＣｈｅｍＥｕｒ．Ｊ．ｐｙｐｐ口］，２０－１２７５１８１：２６１５２６８．，（）２８ＺｈａｎＤＳｅｅ－ｌｉＧＤｎａｍｉｃＤＮＡｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｕｓｎｓｔｒａｎｄｄｉｓｌａｃｅｍｅｎｔｇ乂ｇｙｇｙｉｇ［］ｐＪＮｔ２０－ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．ａ．Ｃｈｅｒａ１１３：１０３１１３．［］，，口）［２９］ＭａｌｏｒｎｙＢ，Ｈｏｏｒ色ｒＪ，ＢｕｎｇｅＣ，ｅｔａＬＭｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎａｌｙｔｉｃａｌａｃｃｕｒａｃｙｏｆ＆／／ＷＯ只ｅ／／口ＰＣ艮：ＡｗａｒｄｓａｎｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｓｔａｎｄａｒｄＪ．Ａｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．［］ｐｐＭ－ｉｃｒｏｂｏｌ２００３６９ｌ：２９６．ｉ，）２９０（３０Ｒａｈ打ＫＤｅＧｒａｎｃＨｓＳＡＣｌａｒｋｅＲＣ，ｅｔａｌ．Ａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎ加ｖＪｅｎｅｓｅ胞ｉＫ：ｅ［］，，ｐｇｑｏｆＳｉａｆ／ｗｏｎｅＷ幻ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｓａｓｐｅｃｉｆｉｃｍｅｔｈｏｄｏｆｄｃＳａｌｍｏｎＪＭ－ｉＱｃＸｘｏｎｏｆｅｌｌａ．ｏｌ．ＣｅｌｌＰｒｏｂｅ．１９９２６４：２７１２７９．［］，（），［３１ＹｕＴＸＣｈｅｎＷ，Ｌｉ，ｅｔａｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｆｔ？ｒｃｏｎｅｔｉｔｉｖｅ］，ｇＱｐｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｎｅｕｒｏ打ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｎｏｌａｓｅｕｓｉｎｇｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅｓａｎｄｇｏｌｄＴ－ｎａｎｏｒｏｂｅ．ａｌａｎｔａ２０１２９３：４３３４３８．ｐＷ，，Ｍ－３２ｉｒｋｉｎＣＡＬｅｔｓｉｎｅｒ艮ｌ＾Ｍｕｃｋ：民ＣｅｔａＬＡＤＮＡｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｔｉｏｎａｌｌ，，，［］ｇｙａｓ巧ｍｂｎｎａｎｏｒｔｃｅｓｎｏｒｃｏｃｍａｅｒａｔｕｒｅ：ｌｉａｉｌｉｔｍａｃｏｓｉｔｉａｌｓ？Ｎ１９９６３８２５９２ｇｐｐ口］，，巧）－６０９６０７．口３］ＬｕｏＣＨ，ＴａｎｇＨ，ＣｈｅｎｇＷ，ｅｔａｌ．ＡｓｅｎｓｉｔｉｖｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒｅｃ－ｓｉｆｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉａｂＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｌｌａｓｓｉｓｔｅｄｓｉｎａｌｐｙｇ２２ 医科大学巧古研齡学位论文ａｍｔＢｔｒ－１ｌｉｆｉｃａｉｏｎＪ．Ｂｉｏｓｅｎｓ．ｉｏｅｌｅｃｏｎ．２０１３４８：１３２３７．ｐ［］，，３４ＬｉｕＣＣ，ＹｅｕｎＣＹＣｈｅｎＰＨ，ｅｔａＬ舶ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｕｓｉｎ１６Ｓｒｉｂｏｓｏｍａｌ］ｇ，［ｇｏｂｅ－ｏｏａｒＤＮＡ／ＲＮＡｐｒｇｌｄｎａｎｐｔｉｃｌｅｓａｎｄｌａｔｅｒａｌｆｌｏｗｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙＪ．Ｆｏｏｄ［］〇－１６〇１２０１３１４１３：２巧６２５３２．，，（）３５ＤｕａｎＮＷｕＳＪＺｈｕＣｅｔａＤ－ｌ．ｕａｌｃｏｌｏｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅ打ｃｅａｎｄ［］，，Ｑ，啤ａｔａｍｅｒ－ｆｉ－ｐｉｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄｍａｎｅｔｏｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｂａｓｅｄｂｉｏａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｓｉｍｕｈａｎｅｏｕｓｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｉＳａ／／ｗｏ＂《／／ａＴｈｉｍｕｒｉｕｍａｎｄｉＳｗＡｙ／ｏｃｏｃｃｗ五ａｗ化ＭＳＪ．ＡｎａｌＣｈｉｍ．ｙｐ［］Ａｃ－ｔａ２０１２７２３：．１６，，３６ｙＳＬｉＹＱＣｈｅｎＨｅｔａＬＤｉｒｅｃｔｄｅｔｅｃｔｉｏ打ｏｆ筑３ｆ／／？ｃｗｅ／／ａｔｈｉｍｕｒｉｕｍｏｎ［］化化ｙｐ－ｅｓｈｒｏｓｉｎｂａｓｅｄｉｍｎｅ化ｅｌａｓｔｉｃｂｓｅｎｓｏｒｓ．ＢｏｓｅｎｓｆｒｄｕｃｅｕｈａｇｅｇｉｏＪｉ．ｐｇｐ［］－Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ２６１１９．２０１０４：１３１３３．，，（）［３７］ＯｈｋＳＨ，ＢｈｉｍｉａＡＫ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｆｉｂｅｒｏｐｔｉｃｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ１／文化片幻ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＥｓｃｈｅｔｉｃｈｉａｃｏｌｉ０７立７．／／７ａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａｆｒｏｍ，－－ｒｅａ－ｔｅａｔｍｅａｔｓａｄｙ）ｔｒｐｌｅｓＪ．ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３３３２：１６６１７１．［］，，（）［３糾ＤｅｖＤａｓＲｏｙＣｈａｕｄｈｕｒｉＣ，ＭａｊｉＳ，ｅｔａｌ．Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｓｉｌｉｃｏｎｂａｓｅｄｓｉｍｐｌｅａｎｄ＊ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｒａｐｐｉｎｇｐｌａｔ仿ｒｍ仿ｒｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ５幻扔ｌｏ内ｅ／／幻ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍｔＢｔｒ２００９２４－ａｈｏｅｎｓＪ．ｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｏｎ．１１：３２１５３２２２．ｐｇ［］，，（）２３ 獻臣科大学硕壬研巧生学位论文第二章基于核酸外切巧…辅助循环扩増和错配型茎环催化自组装技术高灵敏和髙特异性检測通用型ＤＮＡｅｍａ￣本章内容发表于ＣｈｌＣｏｍｍｕｎｉｃｓ２０１５５１４２２０４２２２ｉｃａｔｉｏｎ：，，１引言实现低丰度ＤＮＡ的高灵敏和高特异性检测，对临床诊断、基因治疗、基因变ｗｉｔ异Ｗ及病原菌检测等领域具有重大意义。在过去几十年中，已有多种技术用于ＤＮＡ的检测，如ＤＮＡ微阵列、比色传感器、化学发光传感器、电化学传感器和ｗｔｉ表面等离子共振传感器等。在这些技术中，电化学传感器在检测上不需要昂贵的仪器设备，，具有检测设备小型化、简便快速、灵敏度高和成本低的特点因而ｗ’Ｗ引起了人们的浓厚兴姐。１１：最近，信号放大策略得到了越来越多的关注，因其能克服传统杂交方法的一放大局限，使检测灵敏度得到进步的提升，。目前杂交链反应链置换扩４１５１６＞７［１’］［’］ｎｗｑ增、滚环扩增和酶催化扩增等放大方法己被广泛用于生物分子的检测。在送些方法中，酶的使用，特别是核酸内切酶和核酸外切酶引起了研究者的一一极大兴趣，这特性限制了酶的通用性。。核酸内切酶是种依赖特异性序列的酶＇ＤＮＡ双３－而核酸外切酶ｍ（ＥｘｏＩＩＩ）不需要特定的识别位点，其能识别链的平’ＤＮＡＤＮＡ双３－末端或凹陷端，进而逐步催化去除单核昔酸。此酶对单链和链的ｉ２２Ｐ，ｌＥｘｏＩＩＩ可为ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质的灵敏检测提粘性末端活性很低。因此，２－一３２６一［］供个通用型的平台。另方面，在过去数年中，茎环催化自组装（ＣＨＡ）ＨＡ是一种无酶扩增技术技术得到了很好的发展。Ｃ，在核酸分析的信号放大和转７２８Ｐ，１导方面具有重要作用０ＣＨＡ反应能对信号产生数百倍的扩增放大。同时，ＣＨＡＰｗｚｉ可Ｗ容易地将分析物与黃光、电化学和比色信号等转换结合。尽管ＣＨＡ有诸多优点，但存在由非特异性ＣＨＡ产物引起背景信号的问题，这将降低ＣＨＡ扩增Ｐ３’３４ｌ方法的特异性，限制其在生物分析中的应用。本研究在ＣＨＡ茎环结构的呼吸位点中引入错配碱基Ｗ降低ＣＨＡ的背景信号。ＨＡ一基于ＥｘｏＩＩＩ辅助循环扩増（ＥＲＡ）和错配Ｃ，首次提出了种高灵敏和特异性检测ＤＮＡ的新策略。此传感器呈现出优秀的分析性能，能为生物分析、临床诊断、２４？ 故医科大学巧壬研触学位论文ＤＮＡ检一个简单而强有力的平台病原菌检测和环境监测等领域的测提供。２实验部分２．１材料和试巧ＤＮＡ寡聚核巧酸由生工生物工程技术服务有限公司合成和纯化（中国，上海）。－－ＮＰ它们的序列见表２．１。ＭＣＨ、ＳＴＡＰ、ａ、ＢＳＡ和蛙鱼精ＤＮＡ均购买自西格玛－（０ｂＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ和Ｍ奥德里奇公司美国）。ＥｘｏＩＩＩ、２ｐｉｎ旧ＥＳＴＵｎｉｖｅｒｓａｌＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＥ过ｒａｃ１；ｉｏｎＫｉｔＶｅ＾．５．０均购自宝生物公司（中国大连）。其他的所有试￣１８ＭＱＭｉｌｌｉ，ＭＵｌｉ剂都是分析纯级别的试剂。所有的水溶液均用超纯水食，Ｑｐｏｒｅ）进行配制。表王１本实拴中合成的寡枝普致序列Ｔａｂｌｅ２．１Ｓｅｕｅｎ化Ｓｏｆｈｅｕｓｅｄｏｌｉｎｕｃｌｅｏｉｄｅｑｔｇｏｔｓ＇饼ｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｕｅｎｃｅ３ｇｑ巧）化ｂ－－ＣａｒｅｒｏｅＳＨＣＨＴＴＴＴＧＡＧＴＡＧＡＧＴＣＴＧＡｐｐ（２）６ＴａｒｅｔｌｉｌｔｉｄＴＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴｇｏｇｏｎｕｃｅｏｅＣＴＡＧＴＧＡＴＴＡＧＣＴＨａｉｉｂｅ０ＴＴＧＡＣＣＴＧｒｐｎｒｏ（ＨＯ）ＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧｐＴＡＣＡＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡＡＴＣＡＣＴＡＧＨａｉｒｉｎ防ｂｅ１ＨＵＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡＣＣＡＴＧＴＧｐｐ（ＴＡＧＡＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＡＨａｉｒｉｎｒｏｂｅＧ２（Ｈ２ＴＡＡＧＣＴＡＴＣＴＡＣＡＣＡＴＧＧＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡｐｐ）－ｂＡＧＡｉｏｔｉｎＣＣＡＴＧＴＧＴＡＧＡＴＴＴ－－ｌｉｃｌｅｏｔｉｄｅＣＴＡＧＴＧＡＴＴＡＳｉｎｇｌｅｂａｓｅｍｉｓｍａｔｃｈｅｄｏｇｏｎｕＧＣＴＴＡＴＣＡＴＡＡＣＣＴＧＴ－Ｔｗｏｂａ－ｓｅｍｉｓｍａｔｃｈｅｄｏｌｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＣＴＡＧＴＧＡＴＴＡＡＣＴＴＡＴＣＡＴＡＡＣＣＴＧＴｇ＾ＮｏｎｃｏｍｌｅｍｅｎｏｌｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＴＧｒＣＣＡＴＡＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴＡＣＡＡＴＴＣＡｐｔａｉｙｇ２．２仪器设备本实验的检测仪器是ＣＨＩ６６０Ｄ电化学工作站（上海辰华仪器有限公司），其，中的Ｈ个电极系统包括；拍丝电极为对电极，氯化银电极为参比电极３ｍｍ的金－ｉ电极为工作电极ｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｅｓＵＳＡ）记录。。凝胶电泳的结果用成像仪（Ｂ，２．３探针的制备２５ 戯医稱大学社研巧生学位论文Ｈ监一基于无酶链置换原理的茎环１和是参考我们最近发表的篇文章而设计°‘ｔＷ。所有的茎环探针均在９５Ｃ水浴变性５分钟，接着缓慢冷却至室温，放４Ｃ冰箱备用。２．４电化学生物传巧器的制备（１）将裸金电极用化０５ｈ！的错粉处理、洗涂后浸入食人鱼溶液中１０ｍ，然分钟，巧取出清洗、室温干燥。’（２）将琉基标记的２００ｎＭ捕获探针滴加于上述电极上，置于４Ｃ冰箱中过夜固定。（３）将步骤２中的金电极取出，冲洗，用ＭＣＨ封闭１小时，再次冲洗金电极，然后用蛙鱼精ＤＮＡ和２％ＢＳＡ混合溶液封闭金电极３０分钟避免非特异性ＤＮＡ和酶的吸附。（４）ＥＲＡ反应体系包括；ｌ＾ｉＬＨＯ、ｌ＾ＬＥｘｏＩＩＩ和不同浓度的视ＤＮＡ，反应ＯｍＭＴｒ－的缓冲液为ｌｉｓＨＣｌ缓冲液（ｐＨ７．８，ｌＯｍＭＭｇＣｆｅ，ＳＯｍＭＮａＣＤ。反应°’°３７（：０５８００ＥＩＩＩ反应１，３７（３０体系置于分钟，Ｃ１分钟１＾灭活ｘｏ最后于：复性分钟。（５）在步骤４的ＥＲＡ反应体系里加入２０ｌＬＴＮａＫ缓冲液（Ｈ７．５，２０ｍＭＴｒｉｓ，＾ｐ１４０ｍＭＮａＣｌ，Ｓ．ＯｍＭＫＣＤ。其中包含１０〇１＼１出和１０〇１＾瓜，用（＾｜启动错配ＣＨＡ°３７３０。反应，整个体系置于Ｃ反应分钟’（６）将步骤５中的反应体系加到步骤３中的金电极上，３７Ｃ杂交３０分钟，用ＤＥＡ缓冲液清洗电极。－’ｉ－（７）在步骤６中的电极上加入１．２５鸭ｍＬ的ＳＴＡＰ，置于３７Ｃ反应３０分’ｉ－ＮＰ底物溶液中ＤＰＶ信钟，用ＤＥＡ缓冲液冲洗后，在１ｍｇｍＬ的ａ进斤号检测。３结果与讨论３．１电化学传感器的设计巧理２１Ｈ０、原理图．阐述了通用型ＤＮＡ的传感检测过程。设计种茎环结构；１－悬挂末端Ｈ１和监。Ｈ０设计带有３，能避免被ＥｘｏＩｉｒ消化。Ｈ１和监是参考我２６ 重庆医科大学硕±研姓学位论文一Ｐ４们最近发表的］篇文章设计的。Ｈ０包含两个区域，Ｉ个区域与鞭ＤＮＡ互补，一＇另外个区域与Ｈ１部分互补。在视ＤＮＡ存在下－，Ｈ０与禪ＤＮＡ杂交形成带有３＇平末端的双链ＤＮＡ结构－。核酸外切酶ＩＩＩ能识别３平末端进而逐步催化去除单核一昔酸，释放出範ＤＮＡ和输出ＤＮＡ。释放的视ＤＮＡ又能进入下个杂交和裂解过程（循环Ｉ）。输出ＤＮＡ能与出结合，打开Ｈ１的茎环结构。然后生物素标记的Ｈ２与被一１打开的茎环Ｈ结合，释放出输出ＤＮＡ，它能促发下个错配型茎环催化自组装循环和大量Ｈ－Ｈ２１复合物的产生（循环ＩＩ）。最后，金电极上的捕获ＤＮＡ－Ｈ２复ＳＴ－能特异性地与ＨＡＰ能通过亲和素－１合物杂交。生物素的特异性识别结合一到电极上，导致酶促信号的产生。该双重放大策略能为ＤＮＡ检测提供种高灵敏和高特异性的新方法。ＷＴＭＴＴ／，，，，，…％ｒｍｒ（＾＾＾＂■思ＴＮＴＴＴＴＴＴｔ３ＭＭＩＩＭ川ＩＭＩＩＭＭ川／ＩＩＩＯｕ＾ＤＮＡＶ：Ｖ＼＿、Ｂ）（ＪｉＡＭ￣｜Ｃａｐｔｉｘｅｐｒｏｂｅ２１困．电化学传感器检测把ＤＮＡ的原理Ｆｉｇ．２．１ＳｃｈｅｍａｔｉｃｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｄｅｓｉｇｎｅｄｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｔａｒｇｅｔＤＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎ３．２探针的设计原理尽管ＣＨＡ有很多优点，却有背景信号大的不足。当範ＤＮＡ不存在时ＣＨＡ循环中Ｈ１和Ｈ２会非特异性的识别对方，导致背景信号增大。这将降低反应的信噪比，影响实验的分析性能。茎环结构的呼吸位点位于茎部末端。当望环结构呼吸时，结合位点会被无意的打开。即使粗物质不存在，ＣＨＡ反应也会被引发。为了验证四个呼吸位点对背景信号的的影响，我们在茎环的茎部末端和相邻区域的呼吸位点引入了两个连续的错配碱基（图２２，．序列设计用ＮＵＰＡＣＫ）。错配ＣＨＡ能２７ 重庆医稱大学硕±研充生学位论文有效地降低背景信号。＇３－悬挂末端的长度对Ｅｘｏｍ的活性有重要影响双链ＤＮＡ。如２３图．所示，’Ｈ０和祀ＤＮＡ的３－悬挂末端长度分别为８和６个碱基，Ｗ抵抗ＥｘｏＩＩＩ的消化。基，Ｈ０２３于ＣＨＡ的反应原理的、和４区是特异性设计的引发ＣＨＡ反应。如果ＤＮＡ链的长度过长会引起二级结构，从而导致祀ＤＮＡ与Ｈ０的ｒ区结合困难。因此本文中通用型ＩＥＤＮＡ的长度不应过长，但应不少于１３个碱基。在不久的将来，本文建立的方法有可能用于临床诊断和治疗、病原体检测和环境监测等领域中ＤＮＡ或ＲＮＡ的检测。ＭＵＫＫａｒｏｃｌｉｒｒｓｔ巧－，ＣＭ＾ＩＫｓｔｎＫｔａｒｃａｔ３７．０＜：＇９．香－ｈ。龙＂今叫ＩＫｍｍｒｒｉＤａｒＭＣＭｔｆｗｔｔａｎ：ｔＺＭｋｉａＶｌＫｅｒＴｉｎｗｍ？ｒｔｗｓｒｅｆ一ＭｈＨ２Ｄ３Ｍ２ｍＷｒｈＳｔｅｓｉ、‘－？－＊＇３！３ｙＺｙＨＤＣＩＩＩＭＭ２１ＩＷ２困２．２ＣＨＡ的错化位点Ｆ．２．２ＴｈｅｆｏｕｒｍｉｓｍａｔｃｉｇｈｐｏｓｉｔｉｏｎｓｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｔｏｔｈｅｒｅｖｅａｌｅｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｔｈａｔｃａｎｉｎｉｉａｔｔｅＣＨＡｒｅａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎＨＩａｎｄＨ２ＡＴＧｔｑｊＧ２３Ｔ〇、＇５－ＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡｈｏＧ‘３－ＧＡＴＣＡＣＴＡＡＴＣＧＡＡＴＡＧＴＣＴＡＣ？，＂Ｃ，Ａａｔ－５ＣＴＡＧＴＧＡＴＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡ．＂１２３ｃ。Ｔａｒｅｔ下ｇＧ，ｊ＿３图２．３ＨＯ和化ＤＮＡ的设计原理巧护２．３Ｔｈｅｄｅｓｉｇｎｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｔａｒ拼ｔａｎｄＨＯ２８ 重庆医种大学硕壬研巧生学位论文３．３传感器的电化学表征本实验用电化学阻抗法一（ＥＩＳ）和方波伏安法（ＳＷＶ）来验证每步的修饰情－－３／４况。在ＥＩＳ中，ＦｅＣＮ被用作氧化还原电位测试探针［（）６］，阻抗图谱可用来计算电荷转移阻力一（Ｒｅｔ）。如图２．４Ａ，裸金电极（曲线ａ）阻抗几乎呈条直线，这说明处理后的裸金电极有良好的电子传导特性。当捕获探针自姐装到金电极上后，Ｒｅｔ得到增加（曲线ｂ）。这是由于单链核昔酸带负电荷的稱酸盐骨架阻碍了电子在３－／４’电极和Ｆｅ（ＣＮ）６溶液中的转移。当用ＭＣＨ和ＢＳＡ溶液封闭金电极后，由于这些生物分子能阻碍电子传递，因此Ｒｅｔ明显増加（曲线Ｃ）。最后，当封闭后的电极与空白对照反应后，Ｒｅｔ有轻微的增加（曲线ｄ）。而当封闭后的电极与有祀ＤＮＡ存在的体系反应后，Ｒｅｔ得到极大的增加ｅ）。此（曲线结果说明，当範物质不存在时－，只有少量的Ｈ１Ｈ２复合物会形成。这也证明本实验引用的错配ＣＨＡ使背景信号得到了极大降低。同时我们也用ＳＷＶ进行传感器的表征，结果如图２．４Ｂ所示，一一ＳＷＶ与ＥＩＳ的结果呈现出良好的致性，证明本实验每步都得到了准确的修饰。２。ｌｅｏ１７１ｆｉ５．。。。！‘Ａ０１２３４０．００．１０．２０．３０．４ｚｖＫｎｅｖ困２．４在钦氣化舒溶液中电板的表征西ＥＩＳ（Ａ）和ＳＷＶ（Ｂ）：（ａ）裸金电板：（ｂ）捕获探针修饰后的电板；（Ｃ）ＭＣＨ和ＢＳＡ封闲电板后；（ｄ）ＥＲＡ和错化ＣＨＡ（无耗ＤＮＡ）；（ｅ）ＥＲＡ和错配ＣＨＡ（有托ＤＮＡ）３－＿Ｆ／４ｉ．２．４凹ＳＡａｎｄＳＷＶｇｉｎ０．４ＭＫＣＩｃｏｎｔａｉｎｉｎ０５ｍＭＦｅＣＮａｂａｒｅｅ．ｌｅｃｔｒｏｄｅ（）（巧ｇｔ（）６灿，ｃａｐｔｕ化ＤＮＡｍｏｄｉ打ｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅ（ｂ），ｃａｐｔｕｒｅＤＮＡｍｏｄｉｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅａｆｔｅｒｓｅａｌｅｄｗＵｈＭＣＨａｎｄＢＳＡ（ｃ），ａｆｔｅｒＥＲＡａｎｄｍｉｓｍａｔｃｈｅｄＣＨＡｗｉ化ｏｕｔｄａｎｄｗｉ化ｔａｒｅｔＤＮＡｅ，（）ｇ（）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ２９ 重庆医科大学硕±研巧生学位论文３．４电泳验证和传感器的信号放大效能为了验证ＥＲＡ和错配ＣＨＡ能否按预计进行，我们做了聚丙蹄酌胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）实验。女幽２．５Ａ所示，Ｈ０和少量祀ＤＮＡ的混合液显示２个条带（ｌａｎｅＯ－ｂ），不同于Ｈ（ｌａｎｅｂ）。这归因于ＨＯ能与鞭ＤＮＡ杂交形成１条新条带（ＨＯＴ一复合物ｘｏ山０５０－Ｔ复合物被些残余条带）。当反应体系加入Ｅ反应１分钟后，Ｈ－取代（，ＦＨＨ２ｌａｎｅＣ），这说明ＥＲＡ反应成功完成。当祀物质不存在时复合物的（－ｌａｎｅｄ）。Ｈ２复合物的条带很强（条带很弱然而，当有範物质时，Ｈ１ｌａｎｅｅ）。这些结果说明错配ＣＨＡ能极大降低ＣＨＡ的背景信号。本方案中，Ｅｘｏｍ具有重要的放大作用。５００ｐＭ的祀ＤＮＡ在有ＥＲＡ和ＣＨＡ存在时比仅有ＣＨＡ的ＤＰＶ信号大得多。送是因为ＥｘｏＩＩＩ能辅助循环放大，提高２实验的灵敏度（图．５Ｂ）。因此，我们建立的生物传感平台能够特异和高灵敏的检测鞭ＤＮＡ。ＡａｂＣｄｅＭＢ＿■执如州＊—ＴＢ３．ＩＨ１Ｗ一－—ＨＯＴｌ２．■三－。＞ｐｉｌｌＪ５＊＊＋困２ｌａＨＯｌａｂＨＯ＋ｔＨＯ＋ｔＭ．（Ａ）ＰＡＧＥ电冰：ｎｅａ；ｎｅ：ｔａｉｅｌａｎｅｃ；ｔ：ａｉｅＥｘｏｌｌａｎｅ，ｇ，ｇ，ｄ：ＨＯ＋Ｅｘｏｉｎ＋ＨＩ＋Ｈ２，ｌａｎｅｅ；ＨＯ＋ｔａｒｇｅｔ＋Ｅｘｏｉｎ＋ＨＩ＋Ｈ２和ｌａｎｅＭ：２０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ；（Ｂ）５００ｐＭ的耗ＤＮＡ在有ＥＲＡ和ＣＨＡ和仅有ＣＨＡ与空白对照的ＤＰＶ信号对比枉状函■＋Ｆ．２．５ＡＴｈｅｔｉＰａｎａｌｉｓ：ｌａＨＯｌｂＯ＋ｔｔａｎｅＨＯ十化ｔｉｎａｖｅＡＧＥｓｎｅａ：，ａｎｅ：Ｈａｒｅ＾ｌｃ：１ｅｇ（）ｙｇ呂ＥｘｏＩＩＩｌａｎｅｄ；ＨＯ＋ＥｘｏＩＩＩ＋ＨＩ＋瓜ｌａｎｅｅ；ＨＯ＋ｔａｒｅｔ＋ＥｘｏＩＩＩ＋ＨＩ＋Ｈ２ａｎｄｌａｎｅＩＶＩ：，，ｇ２０ｂＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ．Ｈｉｅ１２％ｎａ化ｒｅｄＰＡＧＥａｎａｌｓｉｓｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｉｎ１Ｘｐｙ＾＾ＴＢＥＶｌＭｇ（ｐＨ８．０）．（Ｂ）ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＤＰＶｐｅａｋｃｕｒｒｅｎｔｓＩｎｔｈｅａｂｓｅｎｃｅ（ｂｌａｎｋ）ａｎｄｔｈｅａｒｅ－ｒｅｓｅｎｃｅｏｆ５００ＭｔｔｗｈｈＣＨＡｗｉ化ｏｕｔＥＲＡａｎｄＥＲＡＣＨＡｐｐｇ（）３０ 重庆医科大学硕±研巧生学位论文３．５实验条件的优化为了获得最佳的分析性能，对实验条件进行了优化。反应的信噪比也被用来ＥＩＩＩ评价传感器的分析性能。作为ＥＲＡ启动子的ｘｏ浓度对传感器的性能有极大的影响。因此，Ｅｘｏｍ的浓度最先被优化。当Ｅｘｏｍ浓度从０．００１Ｕ到０．０１Ｕ时，。０．１信噪比增加明显而从化１Ｕ到化０２Ｕ时，信噪比开始下降。因此００Ｕ被选为Ｅ一一ｘｏＩＩＩ的最优浓度（图２．６Ａ）。般实验优化酶量时，都会达到个平台期。由＇－悬挂末端的ＤＮＡ双链于ＥｘｏＩＩＩ有时也会消化单链或有３，且本实验中Ｈ０的用，对ＥｘｏＩＩＩ很敏感，因此本实验的酶量过大会导致信号的降低量很化。ＥＲＡ一的时间同样也是本实验的个重要参数。当目ＸＯＩＩＩ的浓度为０．０１Ｕ时，信噪比在１０５分钟时为最大值。因此１（．Ｂ）。，０５分钟被选为ＥＲＡ的最优时间图２６２Ｈ２的比值从４：１到１：比在１：１时达到最大值。如图．６Ｃ所示，当Ｈ１与４时，信噪１１Ｈ２反应的最佳比例。图２Ｄ显示了ＣＨＡ反应时间对信噪比的：被选为Ｈ１与．６ＨＡ影响。如图所示，信噪比在３０分钟时达到最大值。因此，３０分钟被选为Ｃ的最优反应时间。＇因＇細０．．００１０．００５０．０１０．０巧００２如６０９０１０５１２０＇，Ｃ／ＵＬＥＲＡｔｉｍｅ／ｍｉｎｐ，５－Ｃ５Ｄ‘１．１０４：１２：１１：１１：２１：４０１５３０化如ＲａｔｉｏｏｆＭ１化Ｈ２Ｉｎｔｅ巧ｃｔｉｏｎｔｉｍｅ／ｍｉｎ困２．６实验条件的优化：丸ＥｘｏＩＩＩ浓度：ＲＥＲＡ奸间；仁ＨＩ：Ｈ２；Ｄ．ＣＨＡ時间Ｆ－－Ａｉ．２乂Ｄｅｅｎｄｅｎｃｅｓｏｆ化ｅｓｉｎａｌｔｏｎｏｋｅｒａｔｉｏｏｎＥｘｏＩＩＩｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＥＲＡｔｉｍｅＢｇｐｇ（），（），ＲａＨＡｉｉｏｎｔｉＤａｒａｍｅｒｃｈａｎｅｓｗｈｉｌｅｔｈｅｔｉｏｏｆＨＩ！：〇Ｈ２ＣａｎｄＣｉＵｅｒａｃｔｍｅｗｈｅｎｏｎｅｐ化ｇ（）（），ｏｔｈｅｒｓａｒｅｕｎｄｅｒｔｈｅｉｒｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ３ｌ 里庆医科大学硕壬研触学位论文３．６传巧器的分析性能在最优的实验条件下，ＤＰＶ峰电流随着合成的鞭ＤＮＡ浓度的不同而产生的变７。．７Ａ可见化见图２．由图２，ＤＰＶ响应信号随着餓ＤＮＡ浓度的増大而増大。图２．７Ｂ展现了在祀ＤＮＡ浓度为１００ｆＭ到５ｎＭ范围内，ＤＰＶ响应信号与祀ＤＮＡ浓度呈现良好的线性关系＝＋化６。相应的回归方程是／山Ａ）１．４７２ｘＭ｜ｇｃ化，相关系）数为０．９９３５，最低检测限为９２ｆＭ，远低于之前报导的基于ＥＲＡ或ＣＨＡ的方法（表ＰＳ—３９１４０２［］．２）。与周等人发表的基于ＣＨＡ和ＥＲＡ的王作相比，本方法有更高的信噪比。这主要归因于错配ＣＨＡ的使用和ＥＲＡ与ＣＨＡ的先后反应顺序。ｆＡｇ：Ｐ—Ｌ￣￣￣．Ｊ＿－．Ｔ．０＊－．１０２０３．００１１１０１００１０００１００００Ｈ／ＶＣ／ｐＭ困２．７（Ａ）电化学传廉器检刑０，０．１，０．５，５，５０，５００和５０００ｐＭ权ＤＮＡ的ＤＰＶ困；（Ｂ）ＤＰＶ峰电流与耗ＤＮＡ浓度对數的校准曲线Ｆｉｇ．２．７（Ａ）ＤＰＶｃｕｒｖｅｓｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ化０，化１，０？或５＾５０，５００，５０００ｐＭ化巧ｅｔＤＮＡ（ｆｒｏｍａｔｏ．ｇ）（Ｂ）ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｙｎａｍｉｃｒａｎｇｅｏｆｔｈｅｄｅｓｉｎｅｄｓｔｒａｔｅ．Ｔｈｅｅｒｒｏｒｂａｒｓｒｅｒｅｓｅｎｈｅｇｇｙｐｔｔｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｏｔｓ３２ 重庆医科大学硕壬研巧生学位论文表１２本方法与其他已报道的ＤＮＡ检測方法的对比Ｔａｂｌｅ２．２ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｐｒｏｐｏｓｅｄａｓｓａｙａｎｄｏｔｈｅｒｒｅｐｏｒｔｅｄｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒＤＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｔＡｎａｌｙｉｃａｌｅｃｈｎｉｑｕｅＳ化ａｔｅｇｙＤｅ化ｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔＲｅ化ｒｅｎｃｅＣｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙＥＲＡ２．５Ｍ３５ｐＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＥＲＡ０．３Ｍ３６ｐＣｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙＣＨＡ１ｎＭ３７ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＣＨＡ０．２ｎＭ３８ＳＷＶＣＨＡ２０ｐＭ３９ＤＰＶＥＲＡａｎｄＣＨＡ％ｆＭＴｈｉｓｗｏｒｋ为了研究传感器对不同ＤＮＡ序列的特异性，如图２．８所示，我们用ＤＮＡ传感器检测５００ｐＭ的四种不同的寡核昔酸（完全互补的寡核昔酸、单碱基错配的寡核昔酸、两个碱基错配的寡核巧酸和非完全互补的寡核昔酸）。图２．８Ａ展示了ＤＰＶ峰电流随着ＤＮＡ序列的不同而产生的变化。图２．８Ｂ显示，尽管本策略对单碱基错配的序列有响应，但是响应值明显低于完全互补的序列。两个碱基错配的寡核巧酸和非完全互补的寡核昔酸的ＤＰＶ响应值非常低，几乎接近空白。此结果表明，本分析方法能有效地区分不同的ＤＮＡ序列，表现出很好的选择性。为了评价传感器的重复性，１００ｆＭ和１ｎＭ的合成祀ＤＮＡ被检测了５次，ＲＳＤ均小于５％，这表明本方法有可接受的稳定性和再现性。４－ＡＡ４－Ｂ呈０．００．１０．２０．３０．４ａｂｏｄｅＥＮ困２．８（Ａ）电化学传感器栓测耗枝苦敵序列、单碱基错化、两个域基错配、非完全互补的寡核皆酸序列和空白对照的ＤＰＶ困（Ｂ）；电化学传感器检測把核普酸序列、单碱基错配、两个碱基错配、非完全互补的寡核导驗序列和空白对照的ＤＰＶ响应柱状困３３ Ｉ載运稱大学硕壬研触学位论文Ｆｉｇ．２．８（Ａ）ＴｙｐｉｃａｌＤＰＶｃｕｒｖｅｓａｎｄ（巧ＤＰＶｐｅａｋｃｕｒ巧ｎｔｓｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ化５００ｐＭｏｆ化ｒｇｅｔｅ－－ｍ－－ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ａ）ｓｉｎｇｌｂａｓｅｉｓｍａｔｃｈｅｄｏｌｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ的ｂｔｗｏｂａｓｅｍｉｓｉｎａ化ｂｅｄ，ｇ（），－ｏｌｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｃｎｏｎｃｏｍｌｅｍｅｎｔａｒｏｌｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｄａｎｄｂｌａｎｋｅｇ（），ｐｙｇ（）（）３．７实际样本中ＤＮＡ的撞測为了评价研制的生物传感器在实际样本检测中的分析性能，将不同浓度的合成祀ＤＮＡ添加到人正常细胞总ＤＮＡ和血清样本中。结果如表２．３所示，对于２００－ｉＤＮＡ１５ｐｇｍＬ的总样品和：稀释血清标本，不同浓度的報分子回收率在％％到１０５％之间。这表明本传感器对于铅ＤＮＡ的检测几乎不受复杂基质的干扰，具有很好的应用前景。表１３授測标准ＤＮＡ添如到人类息ＤＮＡ和血清样本的回收牟ｍｉＴａｂｌｅ２．３ＨｉｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｄｅｔｅｒｉｎｅｄｕｓｎｇｔｈｅｒｏｏｓｅｄｍｅｔｈｏｄｖｉａｓｉｋｉｎｓｎｔｈｅｔｉｃＤＮＡｐｐｐｇｙｉｎ化ｈｕｍａｎｔｏｔａｌＤＮＡａｎｄｓｅｒｕｍｓａｍｐｌｅｓＳａｍｌｅＳｉｋｉｎｖａｌｕｅＡｓｓａｅｄｖａｌｕｅＲｅｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔＲｅｃｏｖｅｒｐｐｇｙｐｙｙＮｏ．ｐＭＭ）％％）（）化（）（１０．５００５０１．３１００．０．２５．００４．９４２．．１９８８３５０．００５１．２５３．２１０２．５４０．５００．４８２．７９６．０５５．．００５１４２，０１０２．９６５０．．００４９．５６１６９９．１＊１－３车６血清样本：洛ＤＮＡ样本：，＊－ＮＡ－１３ｆｏｒｔｏｔａｌＤｓａｍｌｅｓ４６化ｒ挑ｒｕｍｓａｍｌｅｓｐ，ｐ４小结Ｅｘｏ一基于ＩＩＩ辅助循环扩増和错配型茎环催化自组装技术，建立了种高灵敏和高特异性检测ＤＮＡ的新策略。该方法具有较宽的线性范围、高灵敏度和高特异性及重现性，无需ＰＣ民扩増和复杂的标记技术。同时此方法己成功应用于人正常细胞总ＤＮＡ和血清样本中ＤＮＡ的检测。在不久的将来，本文建立的传感策略有望成为临床诊断和治疗、病原茜检测和环境监测等领域检测ＤＮＡ的强有力工具。３４ 献医科大学祗壬研触学位论文参考文献１ＬｉｕＪＷＣａｏＺＨＬｕＹＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｎｉＫ：ｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｎｓｏｒｓＪ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００９［］，，，［］，５－１０９：１９４８１９９８．（）２ＷａｎＦ，Ｅ化ａｚＪＯｒｂａｃｈ民ｅｔａｌ．ＡｎｐｌｉｆｉｅｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆＤＮＡｂｙｔｈｅａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ［］ｇ，，ａｓｓｅｍｂｌｏｆｏｌｍｅｒｓｃｏｎｓｉｓｔｉｎｏｆＤＮＡｚｍｅｗｉｒｅｓＪ．Ｊ．Ａｍ．ＧｈｅｎｔＳｏｃ．２０１１ｙｙｇｙ［］，，ｐ－１巧４３：１７１４９１７１５１．（）３ＬｉｌｍｅｎｔｏｆｌｌｉｉＦＨａ打ＸＬｕＳＦ．ＤｅｖｅｏａｎｅｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａＤＮＡｂｏｓｅｎｓｏｒｗｉｔｈａ［］，ｔｐｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｂｙｄｅｎｄｒｉｔｉｃｇｏｌｄｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｍｏｄｉｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅＪ．［］Ｂｂｓｅ２６１９－２Ｇ２５ｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１１２Ｇ５：．，，（）巧－４ＬｅｅＪＱＣｈｅｏｎＫＨＨｕｈＮａＬＭｉｃｒｏｃｈｂａｓｅｄｏｎｅｓｔｅＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｇ，，和［］ｐｒｅａｔｉｌｉｍｅＰＣ民ｉ打ｏ打ｅｃｈａｍｂｅｒｆｏｒｒａｄａｔｈｏｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＪ．ＬａｂＣｈｉ２００６ｐｐｇ［］ｐ，，６－：８８６８９５．５ＳｃｈｅｎａＭｂａｔｏｎＤＤａｖｉｓ民ＷｅｔａＬｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｍｏｎｉｔｏｒｉｎｏｆｅｎｅｅｒｅ巧ｋｍ，Ｓ，［］，Ｑｇｇ带－ａｔｅｒｎｓｗｉｔｈａｃｏｍｌｅｍｅｎｔａｒＤＮＡｍｉｃｒｏａｉｒａＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９５２７０４６７４７０．：ｐｐｙｙ［］，，Ｗｅ－６ＺｈｏｕＺ｝（ｉＷＺｈａｎＹＪｅｔａｌ．ＤＮＡｒｅｓｏｎｓｉｖｅｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｏｆＡｕＮＰ，［］，，ｇｐｙａ－Ｄｒｅａｔｅｓ；ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｎｏｎｂａｓｅａｉｒｅｄｒｅｉｏｎｓａｎｄｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂｇｇｇｐｇｙＭａ－ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩａｉｄｅｄａｎｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＪ．Ｊ．ｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ２０１３１：２８５１２８５８．ｐ［］，，［７］Ｆｒｅｅｍａｎ氏ＬｉｕＸＱ，ＷｉｌｌｎｅｒＩ．Ｃｈｅｍｉ山ｍｉｎｅｓｃｅｎｔａｎｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ（ＣＲＥＴ）ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡ，ｍｅｔａｌｉｏｎｓ，ａｎｄａ－ｔｅＨＧ－ＳｅＺｎｐｔａｍｅｒｓｕｂ巧ｒａｃｏｉｒｌｅｘｅｓｕｓｉｎｅｍｉｎ／ｕａｄｒｉ）ｌｅｘｅｓａｎｄＣｄ／Ｓ＾ｇＱ＾－ｕａｎｔｕｍｄｏｔｓＪ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１１３３３０：１１５９７１１６０４．ｑ［］，，（）巧］ＣｈｅｎｇＷ，ＺｈａｎｇＷ，ＹａｎＹ氏ｅｔａＬＡｎｏｖｅｌｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｂｉｏｓｅｎｓｏｒ仿ｒｕｌｆｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｐｅｃ巧ｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｂａｓｅｄｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｃｉｒｃｕｌａｒｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔａｎｄｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＪ．Ｂｉｏｓｅｎｓ．ｐ［］目－ｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１４６２：２７４２７９．，，９ｈａｎＤＣａｎＹＲＬａｂ－－ＺＹｉｅｔａｌ．ｅｌｆｒｅｅａｎｄｈｉｈｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ，，［］ｇ，ＬＱｇＳａｓｎａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ－ｓｅｄｂｏｓｅｎＪｌｍｏｎｅｌｌａｕｉｇａｓｕｒ技ｃｅｐｌＤＮＡｂａｉｓｏｒＪ．．［］ＢｏｔｅｃｈｎｏＬ２０－－１２８１２１３４：１２３．ｉ，，６０（）３５ 肪医科大学硕±研触学位论文０ＨｒＡＪＰｋｘｃｏＫＷｅｔａＯｔｍｉｚａｔｏｎｏｆａＲｅｕｓａｂｅＤＮＡ１ＣａｓｈＫＪｅｅｅＬｉｉｌ［］，ｇ，，ｐ，－ｄｏｋｎｏ－ｂａｓｅｕｔｓｅｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｅｎｓｏｒｆｏｒｓｅｕｅｎｃｅｓｅｃｉｆｉｃＤＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｐｑｐｂｔｏｏｄｓｅｒｕｍＪ－．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００９８１２：６５６６６１．［，］，（）［１ＬｕｏＣＨＴａｎＨ，ＣｈｅｎＷ，巧ａｌ．ＡｓｅｎｓｉｔｉｖｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒＵ，ｇｇｓ—ｅｃｉｆｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏ打ｏｆ幻ｃ／ｅｒ／幻ｃｅ幻ｅｂａｃｔｅｒｉａｂｙＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎａｓｓｉｓｔｅｄｓｉｇｎａｌｐ－ｌｉｆｉｂｉｌ１１ａｎｉｃａｔｏｎＪ，Ｂｓｅｎｓ．Ｂｏｅｅｃｔｒｏａ２０３４８：１３２３７．ｐ［］，，［１２］ＳｃｒｉｍｉｎＰ，ＰｒｉｎｓＬＪ，Ｓｅｎｓｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈｓｉｇｎａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，１－２０：４４４５０５．１４０８８，ｌｃｈｅｎＸＬｉｎＹＨＬｉ？ＦｅｔａＬＡｓｉｍｌｅａｎｄｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡ［ｉ，，，ｐｂ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．ｉｏｓｅｎｓｏｒｂａｓｅｄｏｎＤＮＡｃｏｎｃａｔａｍｅｒｓＪ２０１１４７：，，［］２－１２１１８１１１６．［Ｍ］ＨｕＬＨ，ＴａｎＴＴ，ＣｈｅｎＱｅｔａｌＵｔｏａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＢＣＲ／ＡＢＬｆｉｊｓｉｏｎｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｂａｓｅｄｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｓｓｉｓｔｅｄｍｕ化扛ｌｉｃａｔｉｏｎ－ｗｉｃｏｉ）ｌｉｎｉｔｈｕａｎｔｕｍｄｏｔｔａｎＪ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３３５：１０４１０７．ｑｇｑｇｇｇ，［］，［１５］ＧｕｏＱＰ，ＹａｎｇＸＨ，ＷａｎｇＫＭ，ｅｔａｌ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅｉｃ巧－ｔｍｅｒｔ１ａｃｉｄｓｂａｓｅｄｏｎｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｃｉｒｃｕｌａｒｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｐｏｌｙｉｚａｉｏｎ化３（：１〇１１Ｊｌｉｉ２００９３７２０．ＮｕｃｅｃＡｃｄｓ民ｅｓ．３：ｅ．［］，，（）［１６］ＭｕｒａｋａｍｉＴ，ＳｕｍａｏｋａＪ，ＫｏｍｉｙａｍａＭ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ＾ｎｕｃｅｃ－ａｃｓｅｕｅｎｃｅｒｉｍｅｒｅｎｅ－ｉａｔｏｎｒｏｃｒｃｅａｍｃａｔｏｎＮｕｃｌｅｃｌｉｉｄｑｂｙｐｇｉＵｉｎｇｉｌｐｌｉｆｉｉ．ｉ［巧ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２００９３７３：ｅｌ９．，，（）１７ＷａｎＹａｎＣＹＸｌｌｉｇＱｉａｎＹｅｔａ．Ｄｕａｌａｎｆｔｅｄａｎｄｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ［］，ｇ，ｇ，ｐｅ－ｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｎｔＤＮＡＢｉｏｍａｒｋｅｒｓｂａｓｅｄｏｎｎｕｃｌｅａｓｅａｓｓｉｓｔｅｄｔａｒｇｅｔｒｅｃｙｃｌｉｎｇａｎｄｒｏｌｌｉｎｃｉｒｃｌｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓＪ．Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｔｅｃｔｒｏｎ．２０１４５５：ｇｐ［］，，２６６－２７１．ｌＺｕｏＸｌ＾ＸｉａＦＸｉａｏＹｅｔａＬＳｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｎｌｉｆｉｅｄｆｌ脱ｒｅｓｃｅｎｃｅＤＮＡ，，，ｐ［＾ｅ－ｄｔｅｃｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎａｉｄｅｄｔａｒｇｅｔｒｅｃｙｃｌｉｎｇＪ．Ｊ．Ａｍ＊Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［］，２０１０１３２－：１８１６１８１８．，ＬＰＷｕＺｔＣｔｔ－ｔ１９ｉｕｉｕＳｅａｌ．ｏｏｅｒａｉｖｅａｎｌｉｆｉｃａｉｏｎｂａｓｅｄｅｌｅｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ［］，Ｌ，ＱＱｐｐｓｅｎｓｏｒｆｏｒ化ｅｚｅｔｏｍｏｌｅｄｅｔｅｃｔｋ）打ｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓＪ．ＡｎａｌＣｈｅｍ．２０１３８５１７：ｐ，［］，（）３６ 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戯屋科大学巧±研船学位论文９１８－１３１１３９２．３０ＺｈＬＷａｎ－ｅｎｇＡＸｉＪＪ巧ａｌＥｎｚｍｅｆｒｅｅｓｉｎａｌａｔｎｌｉ巧ｃａｔｉｏｎｉｎｔｈｅ．［］，ｇｙｐ，ｇＤＮＡｚｔｏｒｅｔ－ｃａｔａＪ２０１２ｙｍｅｓｅｎｓｏｒｖｉａｇｌｙｚｅｄｈａｉｒｐｉｎａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，［］，４８３－１１２３１１４．：－－３１ＬＹＨＨＲＭａＺｅｔａ．ＴａｒｔｔｒｅｒｅｄｅｎｚｍｅｆｒｅｅａｎｔｏｎｉａｏｕａｎｇＫｌｅｉＨｆｉｃａｉ［］，ｊ，ｇｇｇｙｐｓｔｒａ化ｇｙｆｏｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｉｎｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓａｎｄｔｉ巧ｕｅｓＪ．Ａｎａｌ［］Ｃ６－４６０４ｈｅｍ．２０１４８６９：４５９．，，（）ＺｈＪ－３ｕａｎｇＹＬａｉＷ，ＣｈｅｎＧＮｅｔａｔＡｒｏｌｌｉｎｃｉｒｃｌｅａｎｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｂａｓｅｄＤＮＡ：Ｑ，ｇｐ［＾ｍａｃｈｉｎｅ仿ｒｍｉＲＮＡｓｃｒｅｅｎｉｎｇＣＯ呼ｌｉｎｇｃａｔａｌｔｉｃｈａｉｒｉｎａｓｓｅｍｂｌｙｗｉｔｈＤＮＡｚｍｅｙｐｙｒｍａ－ｆｏｔｋ＞ｎＪ．Ｃｈｅｍ＊Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１４５０：２９３５２９３８．［］，［３３］ＪｉａｎｇＹＳ，ＢｈａｄｒａＳ，ＵＢＬ，ｅｔａｌ．Ｍｉｓｍａｔ：ｃｈｅｓｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆ－ＣｈｅｍｓｔｒａｎｄｄｔｎｕｃｅｃａｃｃｕｉｔｓＪＡｎｅｗ．２０１４２６７ｉｓｌａｃｅｍｅｎｌｉｉｄｃｉｒ．ｇ．，１：ｐ［］，（）－１８７６１８７９．［３４］ＺｈａｎｇＹ，ＹａｎＹ氏ＣｈｅｎＷＨ，ｅｔａｌ．Ａｓｉｎ罕ｌｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｂａｓｅｄｏｎｍｉｓｍａｔｃｈｅｄｃａｔａｌｙｔｉｃＪＢＢ２０－ｈａｉｒｉｎａｓｓｅｍｂｌ．ｉｏｓｅｎｓ．ｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１５６８：３４３３４９．ｐｙ［］，，［３５］ＺｈｏｕＷＪ，Ｇｏｎｇ式ＸｉａｎｇＹ，巧ａＬＱｕａｃｋａｔｉｃｒｅｃｙｃｌｉｎｇａｎｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｌａｂｅ＾ｆｔｅｅａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｖｉｓｕａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＨＩＶＤＮＡＪ．Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｂｅｌｅｃｔｒｏａ２０１４５５：［］，，－２２４２２０．３６ａｅｎＹＣＳｅｔａＡ＂ＳｔＣｉＺＭＣｈＹｉｎａｌａｎＨｆｉｃａｂｎｍｅｔｒｔ，Ｌｉｎ，ｌｄｕａｌｈｏｄ仿ｈｅ［］，ｇｐＤＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｅｘｏ打ｕｃｌｅａ％ＩＩＩＪ．Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，２０１４，６１：［］３７０－３７３．［３７］ＭａＣＰ，ＷａｎｇＷＳ，ＬｉＺＸ，ｅｔａＬＳｉｍｐｌｅｃｏｌｏｒｉｍｅ任ｉｃＤＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｈａｉｒｐｉｎａｓｓｅｍｂｌｙｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄｔａｒｇｅｌ＞ｃａｔａｌｙｔｉｃｃｉｒｃｕｉｔｓｆｏｒｓｉｇｎａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＪ．［］２０４２９２－Ａｎａ：９９２ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１０．，，（）［３巧ＬｉＨＬ＾，ＲｅｎＪＴ，ＬｉｕＹＱ，ｅｔａｌ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｍａｃｈｉｎｅｉｎａｎｐｌｉｆｉｅｄＤＮＡ２０１４－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎＪ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，，５０：７０４７０６．［］Ｌｍｅ－３９ｉＢＬＥｌｌｉｎｔｏｎＡＤＣｈｅｎ义Ｒａｌ：ｋ）ｎａｌｍｏｄｕｌａｒａｄａｔａｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｆｒｅｅＤＮＡ［，，ｐ］ｇｃｉｒｃｕｋｓ化ｍｕｌｔ如ｌｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０１１，３９（１６）：ｅｌ１０．３８ 職医稱大学肥研巧生学位论文４０ＷｕＨＬ－ｖｅｃｏｉｕＹａｎｅｔａｌ．Ｌａｂｅｌｆｒｅｅａｎｄｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ［］，心ＷｇＨＹ，ｄｅｔｅｃｔ－ｉｏｎｏｆＤＮＡｂａｓｅｄｏ打ｔａｒｇｅｔｔｒｉｇｇｅｒｅｄｕａｄｒａｔｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅＪ．ｑｇｙ［］ＢＢｔ２０１５－２８２ｉｏｓｅｎｓ．ｉｏｅｌｅｃｒｏｎ．６６；２７７．，，３９ 献医科大学紙研巧生学位论文文献離电化学ＤＮＡ生物传應器的发展捆要！电化学ＤＮＡ生物传感器由于具有高灵敏度、便携性和准确性等优点，己在多个领域得到广泛应用。在ＤＮＡ生物传感器的分支中，电化学方向已有了近兰十年的发展和应用，ＤＮＡ的嘿岭碱基即鸟嚷岭和腺嘿岭在。当仪器参数为正电位时工作电极产生氧化电流。由于ＤＮＡ的这种特性，电化学ＤＮＡ生物传感器己被广泛应用于临床诊断、生物医学、法医学及环境研究等各领域。在过去几年中，随着纳米技术的应用，各种纳米材料己被用来提高生物传感器的灵敏度。对ＤＮＡ固定策略的清晰认知在传感器的各种应用中是非常有必要的。本文详细阐述了电化学ＤＮＡ生物传感器的初始发展和现状，Ｗ便了解电化学ＤＮＡ传感器的原理和应用。，ＤＮＡ，ＤＮＡ，ＤＮＡ固定和ＤＮＡ相关键词：电化学ＤＮＡ生物传感器损害杂交互作用１引言电化学ＤＮＡ生物传感器具有能克服其他传感器局限性的潜在优势，如快速响应、高灵敏度、高选择性和实验简便等。它们为毒素、抗癌分子、杂交和生物分一Ｗ子等的检测提供了种更优越的方法，ＤＮＡ。最初用可Ｗ固定分子的金属和玻碳电极即可使之成为可能。在ＤＮＡ的４种碱基中，只有嘿吟碱基的氧化可被电一。化学监测到在伏安测定法中，它们都可在个较小的电位产生氧化。除了伏安测定法，利用氧化还原探针的电化学阻抗法和循环伏安法成为研究工作电极上ＤＮＡ碱基薄膜形成能力的有力工具Ｗ。此外，有研究还证明了嘿吟碱基在电极表Ｗ面的氧化变化与氧化还原探针的成膜能力和电子转移特性直接相关。电化学测量所获得的特征峰值可被用来研究ＤＮＡ链分子之间的相互作用。这篇综述回顾了ＤＮＡ生物传感器的初始发展和用于提高其灵敏度和选择性的方法，同时也讨论了用于构建电化学ＤＮＡ生物传感器的多种ＤＮＡ固定方法。４０ 献医科大学硕±研巧生学位论文２巧抬发展二十世纪末是生物传感器开发和分歧的初期。送个时期很少有关于用生物传Ｗ感器检测ＤＮＡ的研巧报道。在巧始阶段，生物传感器的最常见应用为利用葡萄糖氧化酶进行电化学检测葡萄糖。这种酶主要与电位和电流分析法共同使用。理一论上，ＤＮＡ生物传感器可Ｗ为生物体基因组内的特定基因提供个异常敏感和高选择性的检测方法。实际上这种性能是通过下技术被建立起来的：使用放射性Ｗ标记、非放射性候选包括亲和素／生物素和新颖的酶标记系统来鉴定感兴趣的恃定基因的存在。应该注意的是，所有这些技术均需要专业的实验室来完成。１９８７ＭＷＥ年，ａｒｋＡＤｏｗｎｓ等专注于生产廉价和快速检测的生物系统，其具有高灵敏度、低成本和定量的特性，从而导致采用溶出伏安法的电化学ＤＮＡ检测的流行。８Ｅ［］ｅｃｅｋ９８８，当．化ｌ于１年证明了核酸的电化学行为电化学ＤＮＡ传感器有了一进步的发展。他展示了核酸是电活性物质，在束电极上能产生良好的伏安峰。核酸修饰的电极可通过将隶电极浸入ＤＮＡ溶液而简单制备一。该是第支由核酸修一，极大地减少了分析中ＤＮＡ的用量饰的电极。双螺旋中ＤＮＡ的个小的损害也，极谱和伏安方法被提出用于核酸的直接定量可被敏感的鉴定出。从那时起、杂交的检测和ＤＮＡ损伤的评价。在ＤＮＡ的４种碱基中，只有嘿吟碱基的氧化可被电化学监测到。与喀随碱基一－相比，它们都可在个较小的电位产生氧化。哲基自由基添加到嘿吟中，使Ｃ４ＯＨ、Ｃ５－ＯＨ８－０Ｈ加合物自由基得到了增长－ＯＨＣ５－ＯＨ加和Ｃ。Ｃ４和合物自由基经过脱水得到氧化型的嚷吟基团８－ＯＨ，其在还原态能重姐嘿吟。Ｃ加合物自由基上的１８－経基腺嘿岭和甲醜喀晚个电子氧化和１个电子还原分别产生。腺嘿岭的类似反８－４－６■二氨基－５－甲酷嗦巧应产生籍基腺嚷岭和。这些产物在有无氧存在下都能生。－成然而，８経基嚷吟偏好在有氧条件下生成。哲基自由基能使上述ＤＮＡ生成多９１〇［，】种产物。３当下现状目前已有几篇关于固定ＤＮＡ分子层的电化学生物传感器报道，用于测定与ＤＮＡ相互作用的电活性和非电活性的化合物，检测ＤＮＡ的特定序列和监测ＤＮＡ４１ 戯医科大学紙研触学位论文Ｗ１的完整性。这些发现指导了ＤＮＡ生物传感器在临床诊断、法医和生物医学中的发展应用。此外，电化学ＤＮＡ生物传感器为ＤＮＡ相互作用和ＤＮＡ损伤的研究一ＤＮＡ的提供了种新的候选方法。基于诊断试验在很多领域都获得了巨大的发展，ｔｎｉ如遗传学、病理学、犯罪学、药理学、食品安全和法医学等。Ｐｅｄｅｄｏ和民ｉｖａｓ为了发展基于亲和为结合的生物传感器，研巧了ＤＮＡ在玻碳１３，２９［＾他电极上的固定性质们发现，电化学预处理、支持的电解质、齿化物、单价阳离子、ＤＮＡ的长度和组成、固定电位和时间对核酸在碳表面上的电化学反应起着重要的作用。关于单链ＤＮＡ的相关报道文献比较少。不像双链ＤＮＡ，来自小牛胸腺的单－ＤＮＡ链被固定在电极表面用于不同环境污染物的检测，如ＰＣＢ（聚氯联苯）海合物、莽去津、邻苯二甲酸盐、耕Ｗ和ＰＡＨ（多环芳香控）Ｍ。这些研究指出，固定在电极上的单链ＤＮＡ显示出更高的氧化信号，因为单链ＤＮＡ的碱基可Ｗ自由地与邻近的分子反应。尽管送样，双链ＤＮＡ仍经常被使用。因为大多数的基因组一是双链，并且这些双链相互作用的结果更容易让人理解，有利于进步的实际应一用。不管如何—，单链ＤＮＡ在ＤＮＡ杂交研巧中的作用是独无的。３．１ＤＮＡ朵交研究３＋核酸在玻碳电极氧化表面的固定用ｃｏ（ｐｈｅｎ）３作为指示剂。研巧发现，当含有ＤＮＡ的溶液在玻碳电极表面蒸发至干时，ＤＮＡ被紧密地吸附在电极上。嵌入剂作为ＤＮＡ杂交检测的氧化还原标记物是特别令人感兴趣的，因为它们与ＤＮＡ双螺＂＂。ＤＮＡ旋中碱基对形成的７１堆叠相互作用嵌入剂可与双链发生电子交换，与电极么间进行长距离有效的电子转移，而单链ＤＮＡ则无此特性。Ｂａｒｔｏｎ和他的合１６作者最先提出Ｗ远距离的电子转移作为ＤＮＡ杂交生物传感器的基础［１亚甲，其中基蓝被用作ＤＮＡ双链的嵌入剂观测电化学电流。类似的原理，平面芳炫分子、道诺霉素ｎＤＮＡ、漠化乙锭、丫巧染料和蔥醜衍生物亦被用作研巧杂交的指示剂。对ＤＮＡ碱基对的任何干扰都会影响完美的ｎ堆叠而引起电化学电流的衰减一。这特点使得单碱基错配的检测不需要经过严格的洗緣即可进行。３．２ＤＮＡ损伤４２ 誠医科大学社研触学位论文一如前面所讨论的，当ＤＮＡ遇到种分子损害它的结构时，ＤＮＡ中嚷岭碱基氧化信号的变化会被检测到。ＤＮＡ的送种性质为损伤ＤＮＡ的分子测定提供了方法。ＤＮＡ在水污染物中的损伤性质，已被用于探索其制备的生物传感器在废水样ｉｇ［１７１ＷＰＷ、ＤＮＡ生品、环境污染物芳香赔哺廚污染物等分析中的应用。该物传一Ｔｏｘｒｔ感器响应预示废水样品中有个或多个分子结合，此方法与ａｌｅ响应有很好的相关性ｘａｌｅｒｔ（Ｔｏ为用于高通量毒性预测的不可缺少的工具）邱等人开发了双酌Ａ自由基的电化学检测方案，是基于双齡Ａ自由基的ＤＮＡ损伤机制的鸟嘿吟产生的电氧化信号。３．３ＤＮＡ相互作用与测定ＤＮＡ相互作用的传统方法相比，电化学ＤＮＡ生物传感器相互作用的研究近期才起步。最初，ＤＮＡ相互作用的研究是通过光学和多种生物分析方法达ＷＰ成的。Ｐａｎｃｋｙ和ｅｅｔａＵ叫每流动注射系统与倏逝波生物传感器结合用于典型的相互作用的研究。双链ＤＮＡ与其他分子相互作用的研究，特别是与药物的关联，在生命科学中具有重大意义。这些研究阐述了许多药物化合物的作用机制，新的ＤＮＡ－药物生物传感器的设计和体外药物的监测ＤＮＡ。将固定的与溶液中的分析物相互作用之后进行电化学测定己经成为可能。分析物与ＤＮＡ相互作用后的电化学信号可为相互作用的机制、复合物形成的性质、结合常数、结合位点的大小和ｎｔｉ自由基在药物相互作用中的用途提供依据。不同分子与ＤＮＡ的相互作用有多种模式－。这些包括与带负电荷的核酸糖磯酸结构的静电相互作用（通常是非将异性的），碱基对间平面的芳香环体系的相互作用（平面有机分子含有几种芳香稠环常与ＤＮＡＷ插入方式结合，例如柔纽霉素，表阿霉素和放线菌素Ｄ）及ＤＮＡ大小沟的相互作用。小沟结合主要发生在小沟边缘，主要与小分子相结合。由于逸种作用，众多氨键和静电作用力发生在药物和ＤＮＡ之间（ＤＮＡ碱基和憐酸骨架，例如：光神霉素）。大分子主要与大沟槽结合。ＤＮＡ一，ＤＮＡ大沟结合经由氨键与结合发生并能形成个的Ｈ螺旋，如诺氣沙星２４［］〇一－ＤＮＡ相互作用的研究目前己有多种技术用于药物，但没有种技术能独立解决ＤＮＡ相互作用的问题－ＤＮＡ的。因此，急需发展新颖和改良的方法来测定药物４３ 重庆医科大学硕±研巧生学位论文相互作用－ＤＮＡ相互作用的电化学。对药物研究引起人们的高度关注，也为阐述药－ＤＮＡ相互作用的机制提供无限可能－ＤＮＡ物。至今已有多种电极用于药物相互作用的研究，包括玻碳糊电极、金电极、石墨电极、玻碳电极和丝网印刷电极。循环伏安法、、方波伏安法示差脉冲伏安法和计时电位法等电化学技术已被用于药Ｐｙ－ＤＮＡ物相互作用的研究。Ｐ６２７道诺霉素］和环丙沙星［］与ＤＮＡ的相互作用可用ＤＮＡ修饰的碳电极进行研究一。鸟嘿吟信号的减少被用作相互作用机制的个指示剂。溶液的离子强度与分子的结合力密切相关。研究证实：，环丙沙星与ＤＮＡ可能有两种不同的结合模式静电力或插入式。相比较插入式结合，静电结合力对药物而言更有意义。而利福ＮＰＳ１平与单双链ＤＡ的相互作用模式是插入式的。３．４ＤＮＡ在电极上的固定策略ＤＮＡ最简单的固定方法是将短ＤＮＡ模板电吸附在工作电极上一，制备个稳一２９ｌ［レ／定的生物识别层ッ便进步应用。有１篇应用此技术的报道检测限为２５ｌＬ。＾ｇ最近几年，高度敏感和选择性的ＤＮＡ生物传感器的发展是研究者关注的焦点。为了实现ＤＮＡ的高灵敏度检测，不同形态的纳米结构己被用于界面的修饰，旨在增加固定化探针ＤＮＡ的浓度和提高固定化ＤＮＡ的电化学信号。用于电极表面修饰ＰＷ的纳米材料包括金属纳米颗粒、半导体纳米颗粒、纳米线、碳纳米管和纳米孔等。ＤＮＡ生物传感器制备的基本原理如图３．１所示。．ＡＡＥＬｔｄ「ｐｍｅｃｒｏｃ｜ｇＳｕｆｆｉｃｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｎａｎｏｔｎａｉｅｎａｌｓｏｌｍ＂（ｐｙｃｕｍｐｕａｉｌｅｓｉ，ｓｕｉｍｉ＾ｖｉｅｐ）ＩｊＵ］Ｆｕｎｃ－ｔｉｏｎｄｌｉｒｅｄｓｓｄｓＤＮＡ．ａｍｕｓｃｌｆｔｈｙＤＭＡｈｅａｍｓｅｒｍＪｒｓＡｇｐ１．Ｊ……Ｉ３１ＤＮ困．Ａ生物传惠器制备的基本原理Ｆｉｇ．３．１ＢａｓｉｃｓｃｈｅｍｅｏｆＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ４４ 齡医科大学硕±研巧生学位论文Ｋｅｌｌｅｙ研究小姐制造了用纳米线和Ｐｄ纳米结构修饰的电极，并通过控制ＤＮＡ探针的方向取得了ＤＮＡ的髙灵敏检测。此传感器祀ＤＮＡ的检测限约为１．０Ｐ２］冯等人发明的树突状金纳米结构修饰的ＤＮＡ生物传感器取得了相同的检测限。常和他的同事制造了基于导电聚苯胺纳米管修饰的电化学ＤＮＡ传感器，此策略获３３［１得了低于。－Ａ１ｆＭ的检测限通过将敏感的电化学ＤＮＡ生物传感器和ＤＮＡｕ生一物条形码信号放大技术相组合，ＤＮＡ的检测限得到了进步的下降２８ａＭ）（至ｔｗＭ的检测限ｐｑ。用纳米金修饰电极和亚甲基蓝作为电化学指示剂可获得１０ｐ。基于渗杂有饱纳米颗粒的碳纳米管修饰的电化学生物传感器，鞭ＤＮＡ的检测限为ＰＷ（Ｕ２ｐＭ。这些结果表明，界面修饰过程中纳米材料的引入能有效地增大电极的表面积，增强ＤＮＡ的固定特性。下面我们将为大家列举几种关于ＤＮＡ固定的最有效策略。＞对于使用多壁碳纳米管Ｗ提高电化学性能的ＤＮＡ生物传感器，壳聚糖是最常用的粘合剂。壳聚糖能增强多壁碳纳米管的分散性和生物分子在，使碳纳米管一Ｗｌ不同的电极结合的更加紧密。此外，旦与戊二酵交联，固定在碳电极表面的多壁碳纳米管－壳聚糖的化学处理已经被证明极大影响ＤＮＡ的吸附和电氧３８１１化。’－＞－有研究者用乙酸等离子体处理用金修饰的定向碳纳米管，在５端磯酸上通过－ＣＯＯＨ基团ＥＤＣ－－二甲－－蘭胺形成等离子体诱导，在１（３基氨基丙基）３艺基［口９二亚］碳胺盐酸盐］偶联剂存在下増加传感器的灵敏度和选择性。＞琉基盐包被的拍电极制备过程：将琉基盐加入乙酸盐缓冲液和丙丽的混合物中，其后来被烘干，再与硕乙酸赔育和激活水溶性碳水化合物基团Ｗ固定ＤＮＡ［气＞将干净的金电极浸入半脫胺溶液中（形成半脫胺／金电极的单层），接着漫入胶ＩＷ－ＤＮＡ固定在体金溶液Ｗ将ＳＳ胶体金修饰的电极上，形成自狙装模式。中空金纳米球也被用来修饰电极，使电化学ＤＮＡ生物传感器的杂交检测限达到４２Ｍｆ１Ｉ。用镶作为催化剂，修饰有多壁碳纳米管的金电极也被应用到研究中ｐ。－３－－碳纳米管被＾乙基（３二甲氨基丙基）碳化二亚胺激活，与带有氨基末端基团的ＤＮＡ寡核巧酸共价结合时间为１２小时Ｗ１。方研究组利用ＭＢ来检测氧［＾化错电极表面发生的杂交情况。所有逸些策咯均需要经化学修饰的ＤＮＡ序４５ 軟医科大学硕±研胜学位论文＾５＂＂＾列（例如硫醇或氨基修饰）和高度专业的设备＾４结论碳纳米管作为日益重要的纳米材料的代表，具有独特的几何、机械、电子和化学性能。这些优点使其在电化学检测中受到极大的关注。碳纳米管的吸附性能反映其巨大的比表面积。石墨稀片层结构已经被开发用于延长吸附溶出伏安法对重要分析物的检测范围。由于碳纳米管修饰电极的独特性质，其己经被用于硝基４８ｔ］２４６－王硝。工作电极上纳米结构的修饰可苯类爆炸物，，基甲苯的超痕量测定一个策略或多个组合来构造通过下：直接静电组装、共价连接、聚合物包被、－共同混合、溶胶凝胶和电沉积技术。随着电化学ＤＮＡ传感器的不断发展，其在临床诊断、食扁安全和环境监测等领域的应用前景会越来越好。４６ 館医科大学硕丈研胜学位论文参考文献－ＲａｍａｒａＲ．Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｍｅｔａｌａｒｔｔｒｔｔｔｉｃｌｅｍｏｄｉｆｉｅｄｅｌｅｃｏｄｅｓ仿ｒｅｔｅｃｒｏｃａａｌｉｃ［Ｕｊｐｙ－ａｎｄｓｅｎｓｏｒａｌｉｃａｔｈｅｍＬｉｏｎｓＪ．Ｊ．Ｃ．Ｓｃ２００６１１８６：５９３６００．ｐｐ［］，，（）［２］ＧａｙａｔｈｒｉＳＢ，ＫａｍａｒａｊＰ，ＡｒｔｈａｎａｒｅｅｓｗａｒｉＭ，ｅｔａｌ．ＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｂｅｎｚｅｎｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｕｓｉｎｇｃａｒｂｏｎｂａｓｅｄｕｒｉｎｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓｔｈｒｏｕｈｐｇｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｍｅｄａｎｃｅｓｅｃｔｒｏｓｃｏＪ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１４９１１：ｐ［］，ｐｐｙ，（）６－１１３６１２３．口］ＧａｙａｔｈｒｉＳＢ，ＫａｍａｒａｊＰ，ＡｒｔｈａｎａｒｅｅｓｗａｒｉＭ．Ｍｕ化ｉｗａｌｌｅｄｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅｓｂａｓｅｄｐｕｒｉｎｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅｆｏｒｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂｅ打ｚｅｎｅａｎｄｉｔｓｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｕｓｉｎｇ－Ｄｉｌｌｌｉ祗ｒｅｎｔａＰｕｓｅＶｏｔａｍｍｅｔｒＪ．ＩＪＭＣＲ２０１４２：２１１２１７．ｙ，［］５＾［４］ＧａｙａｔｈｒｉＳＢ，ＫａｍａｒａｊＩ，ＡｒｔｈａｎａｒｅｅｓｗａｒｉＭ，ｅｔａｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｒａｃ－ｃｈａ１：ｅｒｚａｔｏｎｏｆｕａｎｎｅａｎｄｂｓｅｔｉｉｇｉｇｕａｎｏｓｉｎｅａｄｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓｏｖｅｒｍｕｌｉｗａｌｌｅｄｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅｍ〇（Ｈｆｉｅｄｇｒａｐｈｉｔｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ口？Ｃｈｅｍ．ＳｃＬＴｒａｎｓ．，２０１４，３４：］（）－１４４６１４５４．［５］ＴｕｒｎｅｒＡＰＦ，ＫａｒｕｂｅＩ，ＷｉｌｓｏｎＧＳ．Ｅｍｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ：ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｍ］．ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，１９８７．＇ｉｌｍａｎｕａ６ＭａｎｉａｔｉｓＴＦｒｂｃｈＪＳａｒｂｒｕｃｋＥＦ．Ｍｏｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｌＭ，，，ｇｙ［］［］ＮｅｗＹｏｒｋｌｉｎ；ＣｏｄＳｐｒｇＨａｒｂｏｒ１９８２．，［７］ＤｏｗｎｓＭＥＡ，ＷａｒｎｅｒＰＪ，ＴｕｒｎｅｒＡＰＦ．ＯｐｔｉｃａｌａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡＪＢｏｒｍｔｅａ１１６６－７０．ｉｒｉｌｓ９８８９：．［］，），（８ＰａｉｖｅｔｒａｎｓｆｅｒｓｌｌｅＳｅｋＥ．Ａｄｓｏｒｔｉｎｖｏｔａｍｍｅｔｒ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎ过ｔｉｏｎｏｆｎａｎｏｒａｍ［］ｐ帥ｐｇｙｇｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆＤＮＡｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄａｔｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓｕｒｆｅｃｅＪ．Ａｎａｌ．良ｉｏｃｈｅｉｕ，１９８８，［］－１７０２：４２４１．）１３（９Ｐ－ａｌｅｃｅｋＥＦｒＤＮＡｔｉｌｉｉｌｉｉｄｉ．ｏｍｏｌａｒｏｒａｈｏｆｏｍｃｒｏａｎａｓｓｗｔｈｎｕｃｅｃａｃｍｏｄｆｉｅｄ［］ｐｇｐｙｙ－ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓＪｌｉ．Ｅｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｓ１９９６８１：７１４．［］，，（）１０ＤｚｄａｒｏｌｕＭＪａｒｕＰＢｒｎｃｏｉＭｅｔａＦｒｅｅｒａｃａｅｄｄａｍａｅｌｘ）ＤＮＡｉｇｉｉｉｌ．ｄｉ＾ｉｎｄｕｃ：［］，ｇａ，ｇｋ，ｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｙ．Ｆｒｅｅ民ａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２００２３２１１：］，（）－１１１５１１０２．４７ 動医科大学硕主研触学位论文－１ｌＫａｍｅｌＡＨＭｏｒｅｉｒａＦＴＣＤｅｌｅｒｕｅＭａｔｏｓＣｅｔａｌ．Ｅｌｅｃ社ｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ［］，，，ｏｆａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｃａｐａｃｉｔｉｅｓｉｎｆｌａｖｏｒｅｄｗａｔｅｒｓｂｙｕａｎｉ打ｅａ打ｄａｄｅ打ｉｎｅｂｉｏｓｅ打ｓｏｒｓＪ．ｇ［］ＢＢｏｅｔｅｃ－ｔｒｏｎ５９９ｉｏｓｅｎｓ．ｉ．２００８２４（４：５９１．，，）［。］ＢｏＹ，Ｙａ打ｇＨ，ＨｕＹ，ｅｔａｌ．ＡｎｏｖｅｌｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒｂａｓｅｄｏｎｒａｈｅｎｅａｎｄｏｌｌａｎｉｌｉｎｅｎａｎｏｗｉｒｅｓＪ．Ｅｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ａｃｔａ２０１１５６６：ｇｐｐｙ［］，，（）２６７６－２６８１．１３ＰｅｄａｎｏＭＬＲｉｖａｓＧＡ．Ａｄｓｏｒｔｉｏｎａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓａｔｃａｒｂｏｎ［］，ｐｎａｎｏＣ－ｔｕｂｅｓａｓｔｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓＪ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．ｏｍｍｕｎ．２００４６１：１０１．，，６ｐ［］（）［１４］ＭａｒｒａｚｚａＱＣｈｉａｎｅｌｌａＩ，ＭａｓｃｉｎｉＭ．ＤｉｓｐｏｓａｂｌｅＤＮＡｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｂｆｏｓｅｎｓｏｒｓ－ｆｏｒｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｍｏｎｉｔｏｒｉｎＡｌＣｈｉｍＡｃｔａ１９９９３８７２９７３０７．ｎａ．．：．ｇ阴，，口）１５ＣａｒｂＭＤＭａｒｃｅｌｌｏＤＰｅｒｕｎｉＭｅｔａＬＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｃａｌＤＮＡｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒ，Ｍ，ｇｉ，ｉｂｉ［］ｏｔｔＪ－ｌｃｃｌｉｃａｒｏｍａｔｉｃｈｄｒｏｃａｒｂｏｎｄｅｅｃｉｏｎ，Ｍｉｃｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ２００８３４：ｐｙｙｙ［］，６３，１（）－１６３１６９．［１６］Ｗｏ打ｇＥＬＳ，ＭｅａｒｎｓＦＪ，ＧｏｏｄｉｎｇＪＪ．Ｆｕｒｔｈｅｒｄｅｖｅｔｏｐｍｅｎｔｏｆａｎｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｂ－ＤＮＡｈｒｉｌｙｉｄｉｚａｔｏｎｂｉｏｓｅｎｓｏｒｂａｓｅｄｏｎｏｎｇｒａｎｇｅｅｌｅｃｔｒｏｎｔｒａｎｓｆｅｒＪ，Ｓｅｎｓ．［］－ＡｔｔＢ２００５１１－ｃｕａｏｒ．ｒＣｈｅｍ．１１１２：５１５５２１．，，１７ＬｕｃａｒｅｌｌｉＦＫｉｃｅｌａＡＰａｌｃｈｅｔｉＩｅｔａｌ．Ｅｌｅｃ化）ｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒ仿ｒａｎａｌｓｉｓ［］，，，ｙ－ｏｆｗａｓｔｅｗａｔｅｒｓａｎｌｅｓＪ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ２００２５８：１１３１１８．ｐ［］，，ｙ）［ｌ＾ＣｈｉｔｉＱＭａｒｒａｚｚａＱＭａｓｃｉｎｉＭ．ＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒｅｎｖｒｏｎｍｅｎｔａｔｒｎ－ｍｏｎＡｎａｉｍＡｃｔａ２００１４２７２５５ｉｌｉｏｉｇＪ．ｌ．Ｃｈ．，；１１６４．［］，（）Ａ－１ａｎＪ民ｉｖａｓＱＬｕｏＤｅｔａｌＤＮｍｏｄｉｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅｆｏｒｔｈｅｄｅ化ｃｔｉｏｎｏｆ［可，，Ｗｇ－ａｒｏｍａｔｉｃａｍｉｎｅｓＪｌｈｅｍ６６８２４．Ａｎａ．Ｃ．１９９：４３６５４３６９．，，（）［］２０ＺｈｅｎＹＹａｎＣＰｕＷ－．ＣａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅｂａｓｅｄＤＮＡｂｉｏｓｅｎ仿ｔｉｇ，ｇ，ｓｏｒｒｍｏｎｉｏｒｎ［］ｇ－－ｉｍ２００９１６１１ｐｈｅｎｏｌｉｃｏｌｌ山ａｎｔｓ阴．Ｍｉｃｒｏｃｈ．Ａｃｔａ６：２２６．ｐ，，（巧［２１ｉｕＹ，ＦａｎＨ，ＬｉｕＸ，ｅｔａＬＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｄａｍａｇｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙ］Ｑｎｓ－ｉｔｕｅｎｅｒａｓＡｒａｓｔｈｒｏｕｈｅｌｅｃｔｒｏｔＪｉｇ化ｄｂｉｐｈｅｎｏｌｄｉｃａｌｇｏｘｉｄａｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｃｈｉｍ．［］Ａｃｔａ２０１０７１－４－１３：％３％９．，，（）２２ＰａｎｃｋＰＣｌｌＨＨｔｙＷｅｅｔａ．巨ｖａｎｅｓｃｅｎｆｌｕｏｒｏｂｉｏｓｅｎｓｏｒ位ｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ［］，ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｂａｓｅｄｏｎＤＮＡｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｐｐＬＢｉｏｃｈｅｍ．４８ 載医科大学社研巧生学位论文Ｂｂ－ｔｅｃｈｎｏＬ１９９５５５２：８７９４．，，（）２３Ｄｏ－Ｔｏ－ｎａｌＢＵｓｌｕＢ０浊ａｎＳＡＶｏＩｔａｍｍｅｔｒｉｃｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅＨＩＶ１ｉｎｈｉｂｉｔｒ：．ｏ［］ｇａｐ，，ｙｄｒｕｆｅｖｒｅｎｚ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｄｓＤＮＡａｎｄｄｒｕｕｓｉｎｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｇＥｉＴｈｅｇｇＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒａｎｄａｄｓｏｒｐｔｉｖｅｓｔｒ料ｐｉｎｇＶＯｆｔａｍｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ打ｏ打ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅｅｎｃｔｒＪＢＢｔｒ２００９２４８２－ｉｌｒａｈｉｔｅｅｌｅｃｏｄｅ．ｉｏｓｅｎｓ．ｉｏｅｌｅｃｏｎ．：３５８２３６４．ｐｇｐ［］，，（）［２４］ＲａｕｆＳ，ＮａｗａｚＨ，ＡｋｈｔａｒＫ，ｅｔａｌ．Ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｓｉｌｄｅｎａｆｉｌｃｉｔｒａｔｅ（Ｖｉａｇｒａ）ｉｎｔｅｒａｃ１：ｉｏｎｗｉｌｂｉｉｉｉｔｈＤＮＡｕｓｉｎｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｃａＤＮＡｏｓｅｎｓｏｒＪ．Ｂｏｓｅｎｓ．Ｂｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２００７ｇ［］，，２２１１７１－２４７７：２４．（）２５ＲａｕｆＳＧｏｏｄｉｎＪＪＡｋｈｔａｒＫ巧ａｌＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌａｒｏａｃｈｏｆａｎｔｉｃａｎｃｅｒ［］，ｇ，，ｐｐｒｕｓ－ＤＮＡ－ｄｇｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎＪ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ，２００５，３７２：２０５２１７．［］（）［２６］Ｗａ打ｇＪ，Ｏｚｓｏ之Ｍ，ＣａｉＸ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｏｆａｎｔ化ｕｍｏｒｄｒｕｇｄａｕｎｏｍｙｃｉｎｗｉｔｈＤＮＡｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄａｔｔｈｅｓｕｒ拉ｃｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｅｔｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．，１９９８，４５（Ｕ：３３－４０．２７ＮａｗａｚＨＲａｕｆＳ，ＡｋｈｔａｒＫ，ｅｔａＬ巨ｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒ仿ｒｔｈｅｓｔｕｄｏｆ［］，ｙ－－ｃｒｏｆｌｏｘａｃｉｎＤＮＡｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎＪ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００６３５４１：２８３４．ｐ［］，，（）＇＊－ＩＣＫＭＫＤＮＡｉｒｏｕｓｉＳＴＧｈｅｉｈｉａｒａｖａ．ｍｏｄｉｆｉｅｄｃａｒｂｏｎａｓｔｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅＰＷＧ，ｇ，ｐａｅｔｏｔｓｔｕｏｆｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｅｔｗｅｃ打艮ｉｆｅｍｉｃｉｎＲＩＦ泣ｎｄＤｉ打ｓｏｌｕｔｉｏｎｐｐｌｉｄｈｅｄｙｂｐ）ＮＡ（ｔ－ａｎｄａｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓｕｒｆａｃｅＪａｉｍＢｏｍｅｄＡｎ２００４４５１８５８．Ｐｈｉ．ａＬ；３６：８．［叮，，（）２ＰｅｄａｎｏＭＬ民ｉｖａｓＧＡ．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａ化ｎｏｆＤＮＡｏｎ虹ｓｓｃａｒｂｏｎｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓｆｏｒ，ｇｙ［刊－ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆａｆｆｉｎｉｔｙｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ？Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２００３，１８３：ｐ口］，口）２６９－２７７．［３０］ＧｏｙａｌＲＮ，ＢｉｓｈｎｏｉＳ．Ｓｕｒｆａｃｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ：Ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔａｎｄＪ－－ｆｕｔｕｒｅ．Ｉｎｄｉａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｎｘ２０１２５１Ａ２：２０５２２５．［］，，＾）３ＧａｓａｒａｃＴａｆｔＢＪＬａ－ＤＭｔＵｔｔｒｔｔ氏ｉｅｒｒｅｅｖｌｉｎＡｅａｌ．ｌｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｅｌｅｃｏｃａａｌｉｃ［Ｕｐ，ｐ，ｙＤＮＡ－ｔ－ｔｒＪＪＡＣｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｔｔｗｏａｎｄｈｒｅｅｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｎａｎｏｅｌｅｃｏｄｅｓ，．ｍ．ｈｅｔｎ．Ｓｏｃ，［］，２００４７０－１２２７１１２６３９：１２２．，（）３２ＬｉＦＨａｎＸＬｉｕＳ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒｗｂｈａｈｉｇｈ［］，，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｏｆ￡ＭｂｙｄｅｎｄｒｉｔｉｃｏｌｄｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｍｃｘＵｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅＪ．Ｂｉｏｓｅｎｓ．ｙｇ［］Ｂｂｅ２６２６１９－ｌｅｃｔｒｏｎ２０１１５：２６２５．，，（）４９ 賊医稱大学赋研猶学位论文３ＣｈａｎｇＨＹｕａｎＹ，ＳｈｉＮ，ｅｔａｌ？巨ｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒｂａｓｅｄｏｎ［引，ｃｏｎｄｕｃｔｎｏａｎｎｅｎａｎｏ－ｉｌｉｌｉｔｕｂｅａｒｒａＪＡｎａｌＣｅｍ２００７７９１：５１１５１１５ｇｐｙｙ．．ｈ．３１．，，［］（）［３４］ＨｕＫ，ＬａｎＤ，ＬｉＸ，幻ａｌ．ＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒｂａｓｅｄｏ打ｎａｎｏｐｏｒｏｕｓｏ－ｕｂｒｇｌｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅａｎｄｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｎｃｏｄｅｄＤＮＡＡｉｏｂａｃｏｄｅｓＪ．Ａｎａｌ．［］ｅｍ８０２３－Ｃｈ２００８：９１２４９１３０．，，（）［３５］ＬｉｕＳ，ＬｉＹ，ＬｉＪ，ｅｔａｌ．ＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆＤＮＡｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｏｎｏｌｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅｍｏｃＨｆｉｅｄｂｎａｎｏｏｌｄａｒｅａｔｅｓＪＢｉｏｓｅｎｓＢｉｏｅｔｅｔｒ．．ｃｏｎ．２００５ｇｙｇｇｇｇ［］，，－２１５：７８９７９５．（）３６ＺｈａｎｇＺＦａ打ＨＺｈａｏＫｅｔａｌ．ＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓｂａｓｅｄｏｎ［］，，，ｐａｌｌａｄｉｕｍ打ａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅｓ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，２００８，－２０２：１３１１３６（）．［３７］ＷｕＳ，ＧｕＸＱ，ＬｉＪＭ，ｅｔａｌ．Ａｒｅａｇｅｎｔｌｅｓｓａｎ５）ｅｒｏｍｅｔｒｉｃｉｍｍｕ打ｏｓｅ打ｓｏｒｂａｓｅｄｏｎ＊ｎａｎｏ－ａｕａｎｄｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅｓ仿ｒｄｅｔｅｃｔｂａｏｆａｈａｆｅｔｏｒｏｔｅｎＪＡｆｉＪｂｐｉ．．．［］－ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ２０１１１０４０８９６１．：７７９０，，（）３ＢｏｌｌｏＳＦｅｒｒｅｒａ艮ｉｖａｓＧＡ．Ｅｌｅｃｔ阳ｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆＤＮＡａｔｌａｓｓｃａｒｂｏｎ，ｙＮＦ［巧，ｇｙｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓｍｏｄｉ巧ｅｄｗｋｈｍｕｌｔｉｗａｌｌｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅｓｄｉｓｐｅｒｓｅｄｉｎｃｈｉｔｏｓａｎＪ．［］Ｅ－－ｌｅｃｔｒｏａｎａｌｓｉｓ２００７１９７８８３３８４０：．ｙ，（），３９ＨｅＤａ－ｉＬ．ＡｌｉｎｅｄｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅＤＮＡｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｅｎｓｏｒｓＪ．Ｃｈｅｍ．［］ｇ［］Ｃｏｍｍｕｎ２００４３－：３４８３４９．．，，［４０］ＭｏｓｅｒＩ，ＳｃｈａＵｃｈａｍｍｅｒＴ，ＰｉｔｔｎｅｒＦ，ｅｔａｌ．Ｓｕｒｆｅｃｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ仿ｒａｎＢ－ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒＪ．ｉｏｓｅｎｓ？艮ｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１９９７１２：．［］，７２９７３７，巧）－４ＣａｉＨｕＣｅＰｅｔａｌ．ＣｏＵｏｉｄＡｕｅｎｈａｎｃｅｄＤＮＡｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ仿ｒｔｈｅ，Ｘ，Ｈ，［Ｕｅ－ｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｂ打ｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡＪ．Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｔｅｍ［］，２００１５１０－８５：７８．，４２ＬｉｕＳＬｉｕＪ，ＨａｎＸ，ｅｔａｌ．ＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｅｂｒｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈｈｏｌｌｏｗ［］，ｇｏｌｄｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓｍｏｄｉｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅａｎｄｉｔｓｅ打ｈａｎｃｅｍｅｎｔｉｎＤＮＡｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｔｏｎＪＢｏｓｅｎｓＢｏｅｅｃｔｒｏｎ２０１０２５７－ａｎｄｈｂｒ：１６４０１６４５ｉｄｉｚａｉ［］，ｉ．ｉｌ．ｙ，，（）４？ＳａｎＳｅＰＪｔＤＮＡ－；ＷａｎＧＷｌｌｉｎｅａｌ．ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓｂａｓｅｄｏｎｓｅｌｆａｓｓｅｍｂｌｅｄ［］ｇｇ氏，ｃａｒｂｏｎ－ｎａｎｏｔｕｂｅｓＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｈｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４３２５４：１４４．［］ｐｙ，，３３１３７（）５０ 輸医科大学硕壬研胜学位论文［４４］ＺｈｕＮ，ＺｈａｎｇＡ，ＷａｎｇＱ，ｅｔａｌ．ＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｕｓ－ｉｎｇｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｌｕｅａｎｄｅｔｅｃｔｒｏｄｅｏｓｋｅｄｚｉｒｃｏｎｉａｔｈｉｎｆｉｌｍｓ０打ｇｏｌｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓｐ－ＪＡｎａＬＣｈｉｍ．Ａｃｔａ２００４５１０２：１６３１６８，．［］，，（）４５ＬｉＪＬｉｕＬｉｕＹＪｅｔａｌＤＮＡｂｉｂｉｒ］．ｏｓｅ打ｓｏｒａｓｅｄｏｎｃｈｔｏｓａｎ打Ｉｍｄｏｅｄｗｉｔｈｃａｂｏｎ［，Ｑ，，ｐｎａｎｏ－ｔｕｂｅｓＪ，ＡｎａＬＢｉｏｃｈｅｍ．２００５１：１０１４．［，，３４６７１］（）Ｌ－－－４６ｉｕＹＷｅｉＷ．ＬａｅｒｂｙｌａｅｒａｓｓｅｍｂｌｅｄＤＮＡｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄｓｉｎｌｅｗａｌｌｅｄｃａｒｂｏｎ［］，ｙｙｇｎａｎｏｔｕｂｅｈｙｂｒｉｄｓｆｏｒａｒｓｅｎｉｃ（ＩＩＩ）ｄｅｔｅｃｔｉｏｎＪ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００８［］，１０６７２－：８８７５．（）［４７］ＺＭｎｇＹＺ，ＷａｎｇＪ，ＸｕＭＬ．ＡｓｅｎｓｉｔｉｖｅＤＮＡｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｅｂｒｉｃａｔｅｄｗｉｔｈｇｏｌｄｎａｎｏａｒ－ｔｃｓ／ｏａｎｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃａｃａ打ｏｔｕｂｅＪｐｉｔｅｐｌｙｐｉｉｄ／ｃｒｂｏｎｎａｓｍｏｄｉｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅ．（）［］Ｃｏ－ｌｌｏｉｄｓＳｕｒ￡Ｒ２０１０７５１：１１８．，，（）７９５４８ＪＨｏｃｅｖａｒＳＢＯｏ防ｖｃＢｔ－Ｗａｎ．Ｃａｒｂｏ打打ａｎｏｕｂｅｍｏｄｉｆｉｅｄａｓｓｃａｒｂｏｎ［］，，ｌｇｇｇｙｅｌｅｃｔｒｏｄｅｆｏｒａｄｓｏｒｔｉｖｅ巧ｒｉｉｎＶＯｋａｍｍｅｔｒｉｃｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｕｔｒａｔｒａｃｅｖｅｓｏｆ２４ｐｐｐｇｌｌｅｌ，，－－６ｔｒｉｉｔｒｏｔｏｌｕｅｎｅＪ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４６２１７６１ｎ］：７乂［，，（）５１ 医献学顶：ｂ研她学位论文致谢时光如白狗过隙，我的硕±研究生生涯即将步入尾声。谨向所有关也和帮助过我的人表示最真擎的谢意！衷也感谢我的导师下世家教授。Ｈ年来，下老师在我的课题选题、完成到论、血文写作中倾注了大量的屯。我获得的点滴成果都离不开下老师的帮助和支持。Ｔ老师思想眷智、治学严谨、学识渊博，不仅在学术上常给予我指导，在生活上也时常给予我无微不至的关怀。下老师教会了我很多为人处事的道理，是我人生的榜样！。在此再次向恩师致Ｗ诚挈的谢意和崇高的敬意深深感谢颜玉蓉老师对我的关也和帮助。颜老师时常在学业上给予我指导，在生活中更是对我多加关怀和帮助。再次向颜老师表达我诚擎的谢意！特别感谢程伟师兄对本谏题的帮助和指导！程伟师兄为我解答了很多实验上的疑惑，使我的实验能够顺利完成。感谢师姐赵丹、李她慧、窗晓娟、李丹丹和师兄张伟、许永杰对我的关怀与＝帮助。特别感谢这年来与我互勉互励，帮助与支持我的同口申波、雷品华和董芳、。感谢师弟张哗李胜强和师妹了小娟对我的大力帮助。感谢重庆医科大学检验医学院对我多年的培养！感谢检验医学院的所有老师和同学！感谢国家自然科学基金（２１０７５１４１和８１３７１９０４）对本课题的支持。感谢我的家人给予我的巨大支持和理解。正是因为有家人的爱，我才有了今天的成绩。感谢所有未提及的曾经关也我，，同学和朋友们支持我的老师。５２ 獻医科大学硕主研巧生学位论文巧读硕±期间撰写的文章目录１ＤａｎＺｈｕＹｕｒｏｎｅｏＳｈｅｎＷｅ．Ｙａ化ＰｉｎｈｕａＬｉｉＣｈｅｎｕａ打ｘｉａｎＪａＳｈｉｉａ，ｇＢ＾换Ｈ＾ｇｊＤ＊ｉｎｇ．Ａｎｏｖｅｌｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｅｎｓｉｎｇｓｔｒａ把ｆｂｒｒａｉｄａｎｄｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｇｙｐ斯－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔＤＮＡ．／／ｗｏｗｅ／／ｏｂｙｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｌｉｆｉｃａｉｏｎａｎｄＡｕＮＰｓｒｏｂｅｐｐ…Ａｎａ－ｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ２０１４；４４５０．ＩＦ：４．５１７，８４６，（）Ｗ＊２．ＷｅｉＣｈｅｎｇ，ｅｉＺｈａｎｇ，ＹｕｒｏｎｇＹａｎ，ＢｏＳｈｅｎ，ＤａｎＺｈｕ，ＰｉｎｈｕａＬｅｉ，ＳｈｉｊｉａＤｉｎｇ．Ａｎｏｖｅｌｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｂｉｏｓｅｎｓｏｒ拉ｒｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｅｃｉｆｉｃｄｅ化ｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｐｂａｓｅｄｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｍｅｄｉａ化ｄｃｉｒｃｕｌａｒｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔａｎｄｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｃａｔｏｎＪＢｏｓｅｎＢｏｅｅｃｔｒｏｎ２０１４－：ＩＦ４５１ｐｌｉｆｉｉ．ｉｓ．ｉｌ．６２２７４２７９．：６．）［］，，（＊３．簡晓娟，黄平，陈进，赵丹，朱丹，Ｔ世家．反相高效液相色谱法同时测定肝－Ｊ２０－癌相关酪氨酸．重１４３９１：１７１８１７２２．缴氨酸对映体［］庆医科大学学报，，（巧４．Ｇｈｅｎｙａｎｇ了ａｏ，Ｙｕｒｏ打ｇＹａｎｉｊＨｍｙｉａｎｇ，ＤａｎＺｈｕ，ＷｅｉＧｈｅ打ｇ，Ｈｕａ打ｇｘｉａｎＪｕ＾Ｓｈ＾ｉａ＊Ｄｉｎｇ．ＡｎｅｗｍｏｄｅｆｏｒｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｂａｓｅｄｏｎ－ｔｅｘｏｎｕｃｌｉｆｉｔｌｅａｓｅＩＨａｓｓｉｓｅｄｔａｒｅｔｒｅｃｃｌｉｎａｍｃａｉｏｎａｎｄｍｉｓｍａ化ｈｅｄｃａｔａｔｉｃｇｙｇｐｌｙｈａ－ｉｒｉｎａｓｓｅｍｂｌＪ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５５１：４２２０４２２２．ＩＦ：６．７１８ｐｙ，［］，（）５．ＰｉｎｈｕａＬｅｉ，ＨｕａＴａｎｇ，ＳｈｉｊｉａＤｉｎｇ，ＸｉａｏｊｕａｎＤｉｎｇ，ＤａｎＺｈｕ，ＢｏＳｈｅｎ，Ｑｕａｎ＊ＣｈｅｎＹｕｒｏｎＹａｎ．ＤｅｔｅｒｍｎａｔｏｎｏｆｔｈｅｉｎｖＡｅｎｅｏｆａｍｏｎｅａｕｓｎｓｕｒｃｅｇ，ｇｉｉＳｌｌｌｉｇｆｅｇｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅａｗｔｓｔｒｅｔａｖｎａｔａｍｅｒａｍｃａｔＭｐｔｏｎｇｉｈｐｉｄｉｐｐｌｉｆｉｉｏｎＪ．ｉｃｒｏｃｈｉｍ，［］Ａｃｔａ２０１５１８２１－２－：２８９２９６ＩＦ：３７１９：．．，（），（）５３
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