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目录摘要...............................................................................................................................IABSTRACT....................................................................................................................III第1章绪论....................................................................................................................11.1引言.........................................................................................................................11.2电化学生物传感器简介........................................................................................11.3生物分析中的DNA放大技术.............................................................................71.4本研究论文的构思..............................................................................................20第2章基于CHA和ALP原位催化形成磷钼酸盐构建免标记的电化学生物传感器用于microRNA-155检测.............................................................................................222.1引言......................................................................................................................222.2实验部分..............................................................................................................242.3结果与讨论..........................................................................................................262.4结论......................................................................................................................33第3章基于DNAzyme辅助的目标物循环和HCR放大策略构建DNA水凝胶电化学阻抗生物传感器用于Hg2+检测................................................................................343.1引言......................................................................................................................343.2实验部分...............................................................................................................363.3结果与讨论..........................................................................................................393.4结论......................................................................................................................45第4章基于双重Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略构建免固载微型化电化学检测系统用于Pb2+检测....................................................................................................464.1引言......................................................................................................................464.2实验部分..............................................................................................................474.3结果与讨论..........................................................................................................504.4结论......................................................................................................................61参考文献........................................................................................................................62硕士期间研究成果........................................................................................................78致谢................................................................................................................................79i 摘要基于DNA扩增技术构建电化学生物传感器的应用研究分析化学专业硕士研究生蔡维指导教师张进教授摘要电化学生物传感器是基于电化学、分子生物学、医学及电子信息技术等多种学科交叉形成的一种新型的分析检测技术。该技术具有响应速度快、灵敏度高、特异性好、易微型化、操作简单及检测成本低等优点，在食品安全、环境检测、生物分析和临床诊断等领域扮演着重要角色，也是当前研究的热门领域之一。然而，随着社会的进步和科学技术的深入，传统的分析检测模式已难以满足当前社会日益增长的需求，因此发展特异性强、灵敏度高、成本低廉且实用性强的电化学生物传感器具有重要意义。近年来，随着大量特异性生物活性分子被开发，新的扩增技术不断涌现，极大的提高了传感器的特异性和灵敏度，为电化学生物传感器的发展注入了新的活力。本研究主要是基于DNA扩增技术和金属离子特异性识别的脱氧核酶（DNAzyme）介导的目标物循环和信号放大技术构建新颖的电化学DNA传感器用于高灵敏检测microRNA-155（miRNA-155）和重金属离子（Hg2+，Pb2+）。其研究内容主要包括以下三个方面：(1)基于CHA和ALP原位催化形成磷钼酸盐构建免标记的电化学生物传感器用于miRNA-155检测。本方案利用催化发夹自组装（CHA）放大技术诱导目标物miRNA-155循环，以在多壁碳纳米管修饰的电极表面固载大量碱性磷酸脂酶（ALP）和亲和素（SA）修饰的纳米复合物。利用ALP催化非活性底物1-磷酸萘钠（NPP）产生的副产物磷酸根离子（PO3-4），在酸性条件下与钼酸钠反应生成具有电化学活性且不溶于水的的磷钼酸盐。产生的磷钼酸盐能够紧紧地吸附在功能化的电极表面，产生强而稳定的电化学信号可直接用于miRNA-155的定量检测。本方案将CHA放大技术、酶催化放大技术与纳米材料相结合，极大的提高了传感器的选择性和灵敏度，在10fmol∙L-1至1nmol∙L-1范围内对miRNA-155检测具有良好的线性关系，其检测限达到1.64fmol∙L-1。（2）基于DNAzyme辅助的目标物循环和HCR放大策略构建DNA水凝胶电化学阻抗生物传感器用于Hg2+检测。I 西南大学硕士学位论文本方案设计了两条直链的DNA探针D1、D2和RNA修饰的发夹探针H2，通过胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶（T-Hg2+-T）配位化学作用，将D1和D2组装在H2的“环”上形成Mg2+-DNAzyme结构，此时的Mg2+-DNAzyme不具有生物催化活性。当体系中存在Mg2+时，Mg2+-DNAzyme将会在RNA修饰的剪切位点特异性剪切，释放出H2中的部分片段和Mg2+-DNAzyme结构。释放出的Mg2+-DNAzyme结构能够参与下一个剪切过程，实现目标物Hg2+的循环放大。在剪切循环后，将产生的DNA片段用以打开电极表面H1的发夹结构，并将其保护起来的序列裸露出来用于进一步杂交。裸露出的序列能够引发聚合链P1和P2中的发夹DNAH3和H4间的杂交链式反应（HCR），从而在电极表面形成一层DNA交联的水凝胶。由于不导电的DNA水凝胶能显著阻碍电极表面的电子传递，因此可利用DNA水凝胶构建高灵敏的电化学阻抗型生物传感器用于Hg2+的检测。该传感器对Hg2+具有良好的选择性和灵敏度，其检测限达到0.042pmol∙L-1。（3）基于双重Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略构建免固载微型化电化学检测系统用于Pb2+检测。本方案基于双重Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略构建了一种新颖的免固载微型电化学检测系统用于Pb2+检测。在该系统中，Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略涉及了两个滚环扩增（RCA）过程。针对两个RCA过程设计了两条不同的DNA环状模板（C1和C2）和一条直链的寡核苷酸探针（L-DNA），C1和C2分别含有8-17DNAzyme序列和GR-5DNAzyme反义序列（anti-GR-5DNAzyme），并且同时含有G-四联体的反义序列。L-DNA由一段Pb2+-DNAzyme的底物序列和一段RCA的引物序列组成。该引物序列在T4DNA连接酶的作用下，能够与C1、C2杂交形成两个DNA锁式结构（L-DNA/Cir1和L-DNA/Cir2）。在Pb2+存在下，DNAzyme能够特异性剪切L-DNA中的底物序列，而剩下的与环形模板杂交的引物片段能够诱导两条不同路径的RCA扩增实现反馈放大，从而形成大量含有重复G-四联体序列的DNA单链。G-四联体序列在K+存在条件下能够折叠形成G-四联体，可用于捕获游离的电活性分子亚甲基蓝（MB）。由于MB/G-联体复合物中的MB扩散到电极表面的速率比游离的MB的扩散速率低，从而导致电化学信号的降低，该信号差异能够被基于碳纤维微电极构建的微型化电化学装置记录。最终，通过结合双重Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略和微型化电化学装置，可在均相溶液中实现对Pb2+准确、灵敏的检测，其检测范围为0.2pmol∙L-1至100nmol∙L-1，检测限达0.048pmol∙L-1。该传感器不仅具有良好的选择性和灵敏度，而且能够将分析试样的体积降低至10µL。关键词：电化学生物传感器；MicroRNA；重金属离子；DNA放大技术II ABSTRACTStudiesonElectrochemicalBiosensorandApplicationBasedonDNAAmplificationTechniqueMajor:AnalyticalChemistryMasterPostgraduated:WeiCaiSupervisor:Prof.JinZhangABSTRACTElectrochemicalbiosensorisanovelanalyticaltechniquebasedontheinterdisciplinaryofelectrochemistry,molecularbiology,medicineandelectronicinformationtechnology,etc.Thistechniquewithdistinctvirtuesoffastresponse,highsensitivity,goodselectivity,easyminiaturization,simpleoperationandlowdetectioncost,haswildlyappliedinthefieldsoffoodsafety,environmentalmonitoringandbioanalysis,aswellinclinicaldiagnosis.However,withtheprogressofsocietyandthedevelopmentofscienceandtechnology,thetraditionalanalyticaldetectionmodelisdifficulttomeetthegrowingneedsofcurrentsociety.Therefore,thedevelopmentofgoodselectivity,highsensitivity,low-costandhighpracticabilityelectrochemicalbiosensorisofgreatsignificance.Inrecentyears,withtheconstantlydiscoveryofspecificbiomoleculesandtheemergenceofnewamplificationtechnologies,theselectivityandsensitivityofbiosensorshavebeensignigicantlyimproved,whichprovidedpromisingprospectfordevelopingelectrochemicalbiosensors.Inthisstudy,threekindsofelectrochemicalDNAsensorwereconstructedbasedonDNAzymeandDNAamplificationtechniqueinducedtargerrecyclingandelectrochemicalsignalamplificationforhighlysensitivedetectionofmiRNA-155andheavymetalions(Pb2+,Hg2+).Themaincontentesofthisthsisarelistasfollows:(1)Alabel-freeelectrochemicalbiosensorformicroRNA-155detectionbasedoncatalytichairpinassemblyandinsituformationofmolybdophosphate.Inthiswork,usingcatalytichairpinassembly(CHA)asanefficientamplificationstrategytoinducetargetrecyclinganplification,wecouldachieveamountofalkalinephosphatase(ALP)andstreptavidin(SA)modifiednanocompositesonthemulti-walledcarbonnanotubes-functionalizedelectrodesurface.Withtheintroductionofinactivesubstrate1-naphthylphosphate(NPP),ALPcouldeffectivelyhydrolyzethesubstratetoproducephosphateion(PO3-4),whichcouldfurtherreactwithacidicmolybdatetoformabundantelectroactiveandinsulatingmolybdophosphateonthesurfaceofelectrode.III 西南大学硕士学位论文Theproducedmolybdophosphatedisplayedastrongchemisorptiononcarbonmaterials,whichwasbeneficialtoproduceastableandstrongelectrochemicalsignalforquantitativedetectionofmiRNA-155.IncorporationoftheCHAstrategy,enzymeamplificationandnanocompositescouldsignificantlyenhancethesensitivityandselectivityofthebiosensor.ThiselectrochemicalmethodformiRNA-155detectionhadachievedagoodlinearrelationshiprangingfrom10fmol∙L-1to1nmol∙L-1withadetectionlimitof1.64fmol∙L-1.(2)AnelectrochemicalimpedancebiosensorforHg2+detectionbasedonDNAhydrogelbycouplingwithDNAzyme-assistedtargetrecyclingandhybridizationchainreaction.Inthiswork,wetookadvantageofthespecificbondingbetweenHg2+andT-mismatchedbasesinDNAprobeD1andD2toforminter-nucleicacidcomplexes,whichcanassembleonribonuclease-modifiedhairpinprobeH2looptoyieldaninactiveDNAzymestructure.InthepresenceofMg2+,theDNAzymehasbeenactivated,andcleavedsubstrateattheribonucleasesitetoreleasesingle-DNA(sDNA)andinter-nucleicacidcomplexes.Thereleasedinter-nucleicacidcomplexesareavailablefornextcleavageprocesstoachievetargetrecyclingamplification.Afterthecleavageprocess,theproducedsDNAcouldhybridizewithcaptureprobeH1toexposeitsconcealedsequenceforfurtherhybridization.Withthehelpoftheexposedsequence,thehybridizationchainsreaction(HCR)betweenhairpinDNAH3andH4inpolyacrylamidechainsP1andP2wasinitiated,andassembledalayerofDNAcross-linkedhydrogelontheelectrodesurface.Theformednon-conductiveDNAhydrogelfilmcouldgreatlyhindertheinterfacialelectronictransferwhichprovidedapossibilityforustoconstructahighsensitiveimpedancebiosensorforHg2+detection.TheimpedancebiosensorshowedanexcellentsensitivityandselectivitytowardHg2+inaconcentrationrangeof0.1pmol∙L-1to10nmol∙L-1withadetectionlimitof0.042pmol∙L-1.(3)Immobilized-freeminiaturizedelectrochemicalsensingsystemforPb2+detectionbasedondualPb2+-DNAzymeassistantfeedbackamplificationstrategy.Inthiswork,anoveldual-DNAzymeassistantfeedbackamplification(DDFA)strategyforhighsensitivedetectionofPb2+waspresentbasedonamicropipettetip-basedminiaturizedhomogeneouselectrochemicaldevice.TheDDFAsysteminvolvestworollingcircleamplification(RCA)processesinwhichtwocircularDNAtemplates(C1andC2)havebeensubtlydesignedwithaPb2+-dependentDNAzymesequence(8-17DNAzyme,anti-GR-5DNAzyme)andanantisensesequenceofG-quadruplex.AndalinearDNA(L-DNA),whichconsistsofaprimersequenceandaPb2+-dependentDNAzymesubstratesequence,couldhybridizewithcirculartemplatestoformtwoDNAcomplexesL-DNA/Cir1andL-DNA/Cir2.InthepresenceofPb2+,IV ABSTRACTthePb2+-DNAzymeexhibitedexcellentcleavagespecificitytowardthesubstratesequenceinL-DNA,leavingprimersequencetotriggertwopathsofRCAamplificationfeedbackprocessandfinallyresultinginmassivelongnanosoloDNAstrandswithreduplicatedG-quadruplexsequences.Andthen,methyleneblue(MB)redoxactivemoleculecouldselectivelyintercalateintotheG-quadruplextoreducethefreeMBconcentrationinthesolution.Thereafter,acarbonfibermicroelectrode-basedminiaturizedelectrochemicaldevicewasconstructedtorecordthedecreaseoftheelectrochemicalsignalduetothemuchlowerdiffusionrateofMB/G-quadruplexcomplexthanthatoffreeMB.Therefore,theconcentrationofPb2+couldbecorrectivelyandsensitivelydeterminedinahomogeneoussolutionbycombiningDDFAwiththeminiaturizedelectrochemicaldevice.ThisprotocolnotonlyexhibitedhighselectivityandsensitivitytowardPb2+withadetectionlimitof0.048pmol∙L-1,butalsoreducedsamplevolumeto10µL.Keywords：Electrochemicalbiosensor;MicroRNA;Heavymetalions;DNAamplificationtechniqueV 第1章绪论第1章绪论1.1引言传感器是指能够对外界的物理或化学刺激做出响应并产生可检测信号的一类装置[1,2]。由于人类自身对生物、物理和化学环境的认知有限，需要借助这类检测装置以提高对自身及生存环境的感知，是人类多方面认识世界的一种重要拓展方式。因人体中的某些生物分子和离子（如激素、蛋白、代谢产物、金属离子等）以及自然环境中的某些化学组分（如重金属、毒素、爆炸物等）的存在及其含量，在一定程度上能够直接反应人体健康状况和环境质量情况，对这些物质的定量检测与人类的生存和发展息息相关。因此，发展高选择、高灵敏的传感器对这些重要标志物的实时定量分析是当前科研工作者追求的目标之一。传感器主要由目标识别元件和信号传导元件两部分组成。其中，目标识别元件是一类对目标物有高的特异性、强的亲和力、宽的动态范围的元素，可以是任意的化学分子或者生物分子。信号传导元件是将识别元件与目标物作用后产生的信号转化为可检测的物理或化学信号，实现对目标物分析检测的装置。自1962年Clark等[3]首次提出将生物识别元件与传感器相结合用于构建生物传感器这一概念后，生物传感技术得以迅速发展，目前已成为一种重要的分析检测手段。生物传感器是利用生物分子作识别元件，将与待测目标物特异性识别后产生的信号通过传导元件转化为可被检测的信号，实现对待测目标物的分析检测[4]。生物传感器具有良好的特异性和灵敏度，已广泛用于生物分析、环境检测和临床诊断等多个领域。根据其信号转化方式的不同，可大致分为压电生物传感器、热敏生物传感器、光学生物传感器和电化学生物传感器。其中，电化学生物传感器因其响应快、灵敏度高、特异性好、操作简单和易微型化等优点受到了广大研究者的青睐[5,6]。1.2电化学生物传感器简介电化学生物传感器是以电极（如固体电极、气敏电极、离子选择性电极等）作为固定载体，将核酸、蛋白、多肽、抗体，甚至细胞等作为识别元件固载在电极表面，通过测量与待测物间的作用而引起电极表面的电流、电势、电阻和电容等电化学信号的传感装置[7]。近年来，基于各种方法、技术构建的电化学生物传感器在生物分析领域取得了重大成果。根据其识别元件大致可分为以下几种类型：酶传感器（enzymesensor）、免疫传感器（immunosensor）、细胞传感器（organellesensor）、核酸传感器（DNA/RNAsensor）、微生物传感器（microbialsensor）、组织传感器（tissuesensor）以及分子印迹传感器（molecularimprintedsensor）[8]。本文将重点介绍电化学酶传感器、电化学免疫传感器和电化学DNA传感器。1 西南大学硕士学位论文1.2.1电化学酶传感器自Updik等[9]将葡萄糖氧化酶固载于电极表面制备了首支电化学酶传感器后，将酶与电化学相结合的传感技术迅速发展成为一种重要的分析检测手段。电化学酶传感器主要是依赖于酶的催化活性，将不能产生电化学信号的底物催化转化为可被检测的电化学活性物质，以改变底物对传感器输出信号的影响，实现对待检测物的定量分析。由于酶具有高度的专一性、高效的催化活性及生物相容性，常用于生物学、化学、医学等各个领域。Li等[10]利用双重信号响应技术构建了一个新颖的电化学生物传感器用于d(CAG)n三核苷酸重复单元检测。如图1.1所示，首先将目标DNA与指示探针（reportprobe）在95°C退火5min形成双链的DNA杂交复合物。接着将形成的DNA复合物与电极表面的捕获探针（SH-DNA-Fc）杂交，打开其发夹结构使得Fc的电化学信号降低。然后，将亲核素标记的辣根过氧化物酶（SA-HRP）孵育在电极表面，利用HRP催化底物产生的信号与Fc的信号变化量间的比率关系，可实现对三核苷酸重复单元的灵敏、准确检测。图1.1双信号电化学酶传感器用于三核苷酸检测示意图[10]Fig.1.1Schematicdiagramofdouble-signalbiosensorformeasuringthesequenceandlengthofd(CAG)nTNRs.Copyright2017ACS.此外，Xu等[11]同样利用生物素（biotin）与SA间的特异性识别作用，在DNA修饰电极上引入了大量的HRP，实现了对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的mecADNA超灵敏检测。其原理图如图1.2所示，首先将目标DNA与7种标记有生物素的信号探针预杂交，接着将杂交后的复合物固载在修饰有DNA四面体的电极表面，2 第1章绪论利用botin与SA间的特异性识别作用将HRP大量固载在电极上，以催化底物产生电化学信号，从而实现对mecADNA的定量检测，其检测限达10fmol∙L-1。图1.2电化学酶传感器用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的mecADNA检测[11]Fig.1.2SchematicinstructionfortheelectrochemicalDNAbiosensorusingaMSPsystemcontaining7signalprobesandatetrahedralnanostructure-basedcaptureprobeforMRSADNAanalysis.Copyright2018Elsevier.1.2.2电化学免疫传感器免疫传感器是基于机体中抗体-抗原间的特异性识别作用而发展起来的一种生物传感技术，该技术起源于20世纪90年代。由于抗体-抗原间的特异性很强，在免疫分析中一般无需对分析试样进行预处理，使得该分析方法的结果具有很强可靠性，常用于临床上抗体、抗原的检测。电化学免疫传感器结合了免疫分析的高选择性与电化学的高灵敏性，具有反应速度快、特异性强、构造简单易于微型化等优点，备受广大科研工作者的关注。根据电化学免疫传感器中的抗体或抗原是否有标记，可分为直接法和间接法两种方法。1.2.2.1直接法直接法是不需要任何标记，直接通过抗体与抗原间的免疫识别作用而进行的分析检测方法。由于抗体或抗原自身携带有负电荷，在电极表面形成免疫复合物时会导致电极的界面参数（如电导率、介电常数、电位、阻抗等）发生改变，产生可检测的电化学信号。该方法具有构造简单、响应速度快等优点，但受到电极表面抗体或抗原的固载量限制，产生的电化学响应信号弱且背景信号强，难以实现高灵敏检测。Cai等[12]以聚硫瑾修饰的纳米金做基底材料，利用硫瑾产生的电化3 西南大学硕士学位论文学信号做内参信号，构建了一个比率型的电化学免疫传感器用于癌胚抗原（CEA）检测。如图1.3所示，在体系中没有CEA时，电极表面对[Fe(CN)3-/4-6]的阻碍作用小，产生了较强的[Fe(CN)3-/4-6]和硫瑾的电化学信号。在体系中有CEA时，CEA与电极表面的抗体特异性结合，使电极表面的负电荷密度增加、空间位阻增大，导致[Fe(CN)3-/4-6]的电化学响应信号减弱。而硫瑾作为基底材料，其响应信号不会受免疫反应的影响，基于此构建的比率型免疫传感器对CEA的检测结果具有较强的可靠性，其检测限为2.2pg∙mL-1。图1.3基于直接法构建的双信号电化学免疫传感器用于CEA的检测[12]Fig.1.3SchematicviewoftheproposedratiometricelectrochemicalimmunosensorbasedonPTh-AuasinternalreferencesignalandK3[Fe(CN)6]solutionasindicativesignal.Copyright2016Elsevier.1.2.2.2间接法间接法是利用抗体或抗原上的标记物产生的电化学响应间接的测定抗体或抗原的浓度。由于酶的催化效率高且易与抗体或抗原标记，因此该方法常用于构建酶联免疫吸附法（ELISA），广泛用于小分子、生物分子和微生物等检测[13]。电化学酶联免疫传感器是将免疫反应的高特异性与酶的高催化活性相结合的一种分析检测技术。该技术主要是通过免疫反应将标记有酶的抗原或抗体固载在电极表面，利用酶催化底物产生的电化学信号与被分析物的量之间存在一定的相关性，实现对目标物的定量检测。根据抗体或抗原的标记不同，可分为夹心免疫传感器和竞争免疫传感器。夹心免疫传感器是基于捕获抗体-抗原-检测抗体这一模式构建的，具有灵敏度高、背景信号低、选择性强等特点，在电化学酶联免疫传感器中起着主导地位。4 第1章绪论如图1.4所示，Hou等[14]基于酪胺修饰的HRP（T-HRP）共轭结构单元构建了超灵敏电化学免疫传感器用于CEA的检测。该体系利用夹心免疫模式将修饰有HRP的AuNPs复合物固载于电极表面。在过氧化氢（H2O2）存在条件下，酪胺能够与邻近的HRP相结合，从而将酪胺-HRP组装到电极表面形成酪胺-HRP重复结构单元。HRP能够催化4-氯萘酚产生不溶于水的沉淀，以增加电极表面的电阻实现对CEA的定量检测，其检测限为0.38pg∙mL-1。图1.4基于夹心法构建的电化学免疫生物传感器用于CEA的检测[14]Fig1.4Schematicillustrationofenzyme-triggeredformationoftyramine-HRPrepeatsforultrasensitiveimmunoassayaccompanyingtyraminesignalamplificationwithenzymaticbiocatalyticprecipitation.Copyright2014ACS.图1.5基于竞争法构建的电化学免疫传感器用于CEA的检测[15]Fig1.5Schematicdiagramforthepreparingofanti-CEA/nano-Au/Au/Fe3O4nanoparticlesandcompetitiveimmunereaction.Copyright2010Elsevier.竞争免疫传感器是基于目标抗原和酶标抗原在固相抗体上的竞争反应，以获得可检测的免疫复合物的一种分析检测方法。其基本原理是先将定量的抗体修饰在固相载体上，再同时加入酶标抗原和目标抗原，由于酶标抗原的浓度或总量是固定的，随着目标抗原浓度的增高，通过竞争反应结合在电极表面的酶标抗原量5 西南大学硕士学位论文就越少，酶催化产生的信号就越低。如图1.5所示，Li等[15]先将CEA抗体固定在固相载体上，利用CEA与HRP-CEA间的竞争反应以改变电极表面的HRP固载量。由于酶的催化信号与CEA的浓度成反相关，因此可实现对CEA的定量检测。此外，Eissa等[16]利用冈田酸与冈田酸修饰的卵清蛋白间的竞争反应，构建了一个电化学竞争免疫传感器用于冈田酸的灵敏检测。1.2.3电化学DNA传感器核酸是由不同的核苷酸聚合而成的生物大分子，是生物遗传信息的载体，也是生物体最基本的物质之一。自1953年Watson与Crick共同发现DNA的双螺旋结构以后，DNA作为一种多功能的生物材料被广泛用于构建生物传感器。其中，电化学DNA传感器是在电极表面固载一层DNA用作敏感元件，利用DNA的结构变换或嵌入的电化学活性物质引起电化学信号（电流、电位、电阻、电导等）的改变而构建的。该方法将DNA的可设计性、特异性、稳定性和生物相容性与电化学的高灵敏度、响应范围广和易微型化结合起来，在DNA、RNA、蛋白、激素、金属离子及活体的实时检测等研究领域具有重要作用。Hu等[17]利用DNA磷酸骨架中的PO3-4在酸性条件下能够与钼酸盐反应原位生成具有电化学活性的磷钼酸盐（PMo3-12O40）用于人表皮生长因子受体2（HER2）检测。如图1.6所示，首先将一段特异性识别HER2的多肽链固载在电极表面，用以捕获目标物HER2。随后通过夹心反应模式将其适体链结合在HER2上，利用适体链的磷酸骨架在酸性条件下能够与钼酸盐反应生成具有电化学活性的PMo3-[18]12O40，以产生电化学信号实现对HER2的检测。Li等基于脱氧核酶（DNAzyme）构建了一个电化学生物传感器用于原位分析DNA与蛋白在基因转录过程中的相互作用。方案首先设计了一条具有双功能的DNA探针，在该探针的3′端具有目标蛋白的结合位点，而5′端具有DNAzyme序列。该探针能特异性剪切电极表面标记有亚甲蓝（MB）的DNA单链。在没有目标蛋白时，DNAzyme对底物链表现出较强的剪切活性，从而使电极表面的MB分子量减少，导致电化学信号降低。而当体系中存在目标蛋白时，目标蛋白将与DNAzyme酶链上的位点结合，使DNAzyme的构型发生改变，从而降低DNAzyme的剪切活性，导致MB大量存在于电极表面产生较强的电化学信号。因此，根据MB信号响应的强弱，可以实现蛋白与核酸作用的实时分析。此外，Wu等[19]通过目标化合物与修饰有MB的单链DNA探针在电极表面的相互作用，改变DNA探针在电极表面的覆盖率，构建了一个信号强弱可控的电化学顺铂传感器。6 第1章绪论图1.6基于DNA组分构建的电化学DNA传感器用于HER2的检测[17]Fig.1.6SchematicillustrationoftheelectrochemicalDNAbiosensorforHER2detection.Copyright2017ACS.1.3生物分析中的DNA放大技术随着科学技术的进一步发展和社会日益增长的需要，对传感器的选择性、灵敏度等性能提出了更高的要求，传统的分析检测模式已无法满足当代社会的需求。因此，大量科研工作者将目光聚焦于发展新型的放大技术，以实现对目标物的高特异性、高灵敏检测。聚合酶链式反应（PCR）是一种变温机制的核酸扩增技术，能够在短的时间里把目标DNA片段以指数的效率不断扩增，是第一个也是应用最为广泛的一种核酸放大技术。尽管该技术具有良好的放大效能和高的准确度，但其自身需要昂贵的热循环设备、复杂的引物链设计。这在很大程度上限制了它在日常检测中应用，因此发展一些简单、高效的放大技术显得尤为重要。随着现代生命科学的发展，各种各样的核酸扩增技术不断涌现。核酸等温扩增技术（Nucleicacidisothermalamplification）因其能够在恒温下快速、有效的对核酸进行扩增，在一定程度上克服了PCR的缺点，是一种非常有前景的核酸放大技术。基于其放大的机理，可以分为以下三种类型：核酸酶辅助型、DNAzyme辅助型和无酶反应型。1.3.1核酸酶辅助型放大技术1.3.1.1等温链置换放大技术等温链置换放大（Stranddisplacementamplification,SDA）技术是在1992年walker等[20]提出的一种新型的核酸扩增放大技术。该技术主要利用具有链置换活7 西南大学硕士学位论文性的聚合酶在限制性内切酶剪切核酸产生的缺口处聚合形成新的核酸序列，并将原有的核酸序列置换下来实现快速连续的扩增。Jiao等[21]将三维的银纳米颗粒（AgNPs-3D）与SDA放大技术相结合用于增强电致化学发光信号，实现了DNA的灵敏检测。其原理如图1.7所示，首先设计了一条能够与目标DNA序列杂交形成互补的双链结构的单链DNA。在聚合酶的作用下，以单链DNA为模板，沿着目标序列的3′端进行延伸，并用核酸内切酶在其特异性识别的位点进行剪切产生缺口。此时，聚合酶将从缺口处进一步延伸，将扩增出的DNA置换下来，如此循环往复，将会产生大量的短链DNA。同时，将修饰有CdSe量子点的发夹DNA探针固载在AuNPs修饰的电极表面，由于CdSe量子点与AuNPs间存在能量转移，其电致化学发光（ECL）信号被猝灭。当生成的短链DNA孵育在电极表面时，发夹DNA猝灭探针的发夹结构将被打开，使ECL信号得以恢复。进一步的将AgNPs沉积在3DDNA网状结构上，能够实现ECL信号的显著增强，从而实现对DNA的灵敏检测。图1.7基于SDA和AgNPs-3D放大技术构建的ECL传感器用于DNA的检测[21]Fig.1.7SchematicrepresentationofECLbiosensorforDNAdetectionbyusingcyclingSDAandAgNPs-3Dnanostructuredoubleamplificationtechnique.Copyright2017Elsevier.Wang等[22]将酶促信号放大技术与SDA扩增技术相结合构建了高灵敏的电化学生物传感器用于miRNA检测。其原理如图1.8所示，首先设计了一条发夹DNA探针，该探针能够与目标miRNA序列杂交，将其发夹结构打开。在聚合酶和内切酶的作用下，以打开的DNA探针为模板，进行SDA反应，能够产生大量的DNAtrigers。将产生的DNAtrigers孵育在修饰有捕获探针的电极上，从而将检测探针8 第1章绪论固载在电极表面以结合碱性磷酸酯酶。利用酶催化α-萘磷酸盐可实现目标物的定量检测，其检测限达40pmol∙L-1。此外，Li等[23]利用Pb2+-DNAzyme剪切底物产生的DNA片段诱发SDA放大反应，实现了Pb2+的灵敏检测，其检测限为200pmol∙L-1。Chen等[24]首先利用SDA诱导的目标物循环在电极表面形成biotin标记的DNA双链，再通过SA与biotin的特异性结合，将环形的DNA模板引入电极表面进行滚环扩增。最后将biotin标记的DNA探针固载在扩增产物上以捕获碱性磷酸酯酶，利用碱性磷酸酯酶催化α-萘磷酸盐产生的电化学信号可实现对DNA的超灵敏检测。图1.8基于SDA反应构建的电化学传感器用于miRNA的检测[22]Fig1.8SchematicrepresentationoftheelectrochemicalbiosensorformiRNAdetectionbasedonenzymaticandmolecularbeaconmediatedSDA.Copyright2015Elsevier.1.3.1.2滚环扩增放大技术滚环扩增反应（Rollingcircleamplification,RCA）是1998年Zhang等[25]借鉴环状病原体微生物中DNA滚环式的复制方式构建的一种核酸扩增技术。RCA的是以环形的DNA为模板，线状的DNA链为引物，将模板和引物链杂交形成具有缺口的DNA双链，并用连接酶将切口连接，形成环形的锁式结构。在聚合酶作用下，以环形的DNA为模板，不断合成与模板序列互补的线状单链DNA。此外，还可在扩增产物上引入一段新DNA片段，从而将引入的DNA片段做引物链，扩增产物作模板序列进行指数扩增。与SDA不同的是，RCA的一次聚合延伸能够得到多个模板的拷贝数，能够在1h内进行约103倍放大。RCA的扩增产物是一条具有重复序列的线状单链DNA，常用于固载信号探针或者形成串联的G-四联体结构，用于信号的输出放大。如图1.9所示，Tang等[26]9 西南大学硕士学位论文通过在RCA的产物上固载量子点标记的信号探针，构建了超灵敏的电化学检测体系用于Pb2+检测。该方法将Pb2+-DNAzyme的部分底物序列用作RCA反应的引物序列，利用DNAzyme链与底物链形成的DNA双链结构，将RCA的引物序列封闭在Pb2+-DNAzyme结构中。当目标物Pb2+存在时，底物链被特异性剪切，释放出用作RCA引物的DNA片段。通过与环形模板结合介导RCA扩增，生成具有大量重复序列的DNA单链用以捕获量子点修饰的DNA信号探针，以实现对Pb2+的放大检测。图1.9基于RCA放大技术构建的电化学检测体系用于Pd2+的检测[26]Fig.1.9PrincipleoftheRCA-basedsensingsystemforPd2+.Copyright2013Elsevier.Yang等[27]利用多组分的核酸酶（MNAzyme）介导的RCA扩增用于固载大量的酶，实现miRNA超灵敏检测。其原理如图1.10所示，该方法设计了一个MNAzyme体系，利用MNAzyme剪切下来的DNA片段与电极表面的捕获探针杂交，再通过亲和素与生物素间的识别作用将RCA的锁式探针结合在电极上，介导RCA扩增。将RCA扩增出的大量重复序列与检测探针相结合，在电极表面引入大量的碱性磷酸酯酶，从而实现对miRNA的超灵敏检测。此外，Ji等[28]利用核酸内切酶诱导的RCA扩增构建了超灵敏的电化学生物传感器用于DNA检测。在该方案中，首先用目标DNA和辅助DNA在电极表面发夹型DNA探针的“环”形处杂交，形成具有核酸内切酶识别位点的“Y”形结构。接着用核酸内切酶对发夹型DNA进行剪切，释放出目标序列参与下一个剪切过程。随后将发夹型DNA探针“环”状的部分序列用作RCA的引物序列，用以诱导RCA扩增。最后将标记有量子点的DNA分子信号探针固载在RCA产物上，用于DNA的超灵敏检测，该传感器检测限达11amol∙L-1。Huang等[29]基于分子探针介导的链置换和RCA放大技术构建了高灵敏的电化学生物传感器用于乙型肝炎病毒基因的检测。该体系中，首先用目标DNA打开电极表面的发夹型DNA的发夹结构，并用另一段引物DNA与打开的发夹型DNA裸露的粘性末端部分互补杂交，接着以引物DNA序列为模板，利用聚合酶phi29的置换活性将目标DNA从电极表面实置换下来，实现目标物的循环放大。同时，将引物DNA的部分序列作为RCA的引物序列，介导RCA10 第1章绪论反应扩增出富含鸟嘌呤（G碱基）的DNA单链，通过MB与G碱基间的特异性识别，可实现对目标序列的高灵敏检测。图1.10基于RCA放大技术的电化学生物传感器用于miRNA的检测[27]Fig.1.10SchematicrepresentationoftheelectrochemicalbiosensorformiRNAdetectionbasedonRCA.Copyright2016Springer.图1.11基于RCA放大技术的电化学生物传感器用于Pb2+的检测[31]Fig.1.11SchematicillustrationofthemultipleamplificationprocessesforPb2+detection.Copyright2018Elsevier.此外，Guo等[30]通过夹心反应模式将RCA的引物序列固载在电极表面，利用RCA扩增反应生成的串联G-四联体序列与氯高铁血红素（hemin）作用形成具有催化活性的过氧化物模拟酶活性的hemin/G-四联体，用于信号的输出放大，构建了高灵敏的电化学生物传感器用于大肠杆菌检测。Qing等[31]利用Pb2+-DNAzyme11 西南大学硕士学位论文诱导的RCA扩增，在电极表面形成多功能的hemin/G-四联体，用于Pb2+的放大检测。其检测原理如图1.11所示，该体系首先在将Pb2+-DNAzyme固载于电极表面，当有目标物存在时，Pb2+将对S1特异性的剪切，同时释放出DNAzyme链和Pb2+用于下一个剪切循环。电极表面S1剩下的片段将作为捕获探针，用于固载修饰了DNA探针S3和RCA引物序列的AuNPs复合物。将RCA扩增生成的G-四联体序列与hemin作用形成hemin/G-四联体纳米线，用于催化底物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），从而实现对Pb2+的放大检测。此外，Hou等[32]同样采取上述原理，利用电极表面的捕获探针固载修饰有RCA引物序列的AuNPs复合物，介导RCA反应生成hemin/G-四联体纳米线，用于催化底物苯胺产生电化学信号，实现对DNA的超灵敏检测。1.3.2DNAzyme辅助型蛋白酶因其自身良好的催化活性、特异性，能够显著提高生物传感器的分析性能，受到广大科研工作者的青睐。但由于其价格昂贵、稳定性差、易失活等缺点，极大了限制了它在复杂的生物试样和环境试样中的应用，因此研究新型的人工模拟酶具有重要的意义。DNAzyme，是一种通过指数富集配体系统进化体外筛选技术（SELEX）分离出来的具有催化活性的核酸工具酶，具有类似于蛋白酶的催化活性。与蛋白酶相比，DNAzyme具有更高的稳定性、热可复性和可设计性；同时其制备和纯化简单、廉价易得，常用于生物传感、环境检测、临床诊断和治疗等多个研究领域。目前，常见的DNAzyme主要分为RNA剪切型和G-四联体催化型两种类型。其中RNA剪切型的DNAzyme需要特定的小分子和金属离子等辅助因子存在条件下才能对核酸底物进行剪切，产生核酸片段用于信号的输出放大。Yang等[33]将CdSe量子点与DNAzyme相结合，构建了灵敏的电化学生物传感器用于Ni2+检测，其原理如图1.12所示。该体系首先将Ni2+-DNAzyme固载于电极上，接着将CdSe量子点修饰在DNAzyme底物链的末端。当体系中存在Ni2+时，Ni2+-DNAzyme的剪切活性被激活，Ni2+能够对底物进行特异性剪切，导致含有CdSe量子点的DNA片段和DNAzyme酶链释放到溶液中，而剩余在电极表面未被剪切的DNA片段所包含的CdSe量子点可通过阳极溶出伏安法进行检测。因此，根据目标物引起的电化学信号的变化量可以实现对Ni2+的定量检测。Jiang等[34]基于β-环糊精的主客体识别和Mg2+-MNAzyme构建灵敏的电化学生物传感器用于DNA的放大检测。其原理如图1.13所示，该体系首先设计了两端标记有Fc的发夹型DNA探针H-1，在没目标DNA时，受到发夹型探针S-1的阻碍作用无法形成Mg2+-MNAzyme，H-1将保持原有的发夹构型。由于位阻效应，H-1中的Fc不能与电极表面的β-环12 第1章绪论糊精结合，只能产生较弱的电化学信号。当目标存在时，S-1的发夹结构将会被打开形成Mg2+-MNAzyme用以特异性剪切H-1以产生含有Fc的两条DNA单链。此时，DNA单链中的Fc能够被电极表面的β-环糊精结合，产生较强的电化学信号。生成的MNAzyme又能参与多个循环，从而可以实现对目标DNA的放大检测。图1.12基于DNAzyme-CdSe纳米复合物的电化学生物传感器用于Ni2+的检测[33]Fig.1.12SchematicillustrationoftheelectrochemicalbiosensorforNi2+detectionbasedonaDNAzyme-CdSenanocomposite.Copyright2016Elsevier.G-四联体型的DNAzyme是将富含G碱基的序列在一定条件下折叠形成四联体结构，再将hemin嵌入G-四联体结构中形成hemin/G-四联体。在H2O2存在时，hemin/G-四联体能够催化氧化底物产生电化学信号，从而实现对目标物的定量检测。Li等[35]利用T-Hg2+-T的配位化学和T4连接酶的的连接作用，将富含G碱基的DNA序列固载到了电极表面，实现了对Hg2+灵敏检测。其原理如图1.14所示，首先将捕获探针Cp固载于电极表面，在Hg2+存在条件下，Cp探针和Ap探针通过T-Hg2+-T的配位化学作用与Lj探针形成部分杂交互补的双链DNA。在T4连接酶的作用下，Cp探针和Ap探针将会被连接，形成一条DNA单链。由于Ap探针的末端富含G碱基，在K+和hemin的作用下将会形成hemin/G-四联体结构。利用hemin/G-四联体对四甲基联苯胺（TMB）的催化，可实现对Hg2+的灵敏检测。13 西南大学硕士学位论文图1.13基于主客体识别和DNAzyme辅助的放大技术构建的生物传感器用于DNA的检测[34]Fig.1.13SchematicillustrationoftheelectrochemicalDNAbiosensorbasedonthehost-guestinteractionandMg2+-assistantDNArecycling.Copyright2017ACS.图1.14基于酶介导形成的DNAzyme构建的电化学生物传感器用于Hg2+的检测[35]Fig.1.14PrinciplesoftheelectrochemicalbiosensorforHg2+sensingbasedonligase-mediatedformationofDNAzyme.Copyright2016Elsevier.此外，Zhou等[36]利用夹心反应模式将富含G碱基功能化的纳米复合材料固载于电极表面，利用hemin/G-四联体对底物L-半胱氨酸的催化可实现对心肌肌钙蛋白（cTnI）定量检测，检测限达0.15pg∙mL-1。其检测原理如图1.15所示，首先将富含G碱基的单链DNAS1和S2组装在Pt@Mn-CeO2表面形成三维的纳米网状复合物（Pt@Mn-CeO23DN）。接着在形成的Pt@Mn-CeO23DN表面修饰上检测抗体，采用夹心反应模式将其固载于电极表面。在K+和hemin的作用下，S1和S2上的富G序列将会形成hemin/G-四联体，可对底物L-半胱氨酸进行催化产生电化学信号，从而实现对cTnI的定量检测。14 第1章绪论图1.15基于G-四联体型的电化学生物传感器用于cTnI检测示意图[36]Fig.1.15SchematicillustrationoftheelectrochemicalbiosensorsfabricationprocessforcTnIdetection.Copyright2017Elsevier.1.3.3无酶反应型放大技术尽管酶辅助的核酸放大技术能够显著的提高传感器的选择性和灵敏度，但在实验中涉及到了酶催化反应过程，需要对反应的实验条件进行优化和控制，这无疑增加了体系的操作流程和实验的难度。同时，酶需要一定的条件保持其催化活性，这些反应条件极大的限制了电化学酶传感器在实际样品中的应用。因此，构建无酶的放大技术用于复杂的环境和生物试样中检测已成为当前非常热门的课题。其中，杂交链式反应（HCR）和催化发夹自组装（CHA）放大技术是当前比较受关注的无酶放大技术之一。1.3.3.1催化发夹自组装放大技术催化发夹自组装放大技术（Catalyzedhairpinassembly），是由以一段单链的核酸启动探针和两个发夹结构的探针组成，通过核酸间的杂交驱动分子间自下而上的自组装，实现目标物的循环放大的一种放大技术[37]。其原理图如图1.16所示，发夹探针A（图1.16a）由a，b和c三个部分组成，每个部分都包含有一个特殊的位点称为支点，分别表示为at，bt和ct。发夹探针B（图1.16b）由a和b两个部分组成，均含有一个支点分别表示为at*和bt*。在没有启动探针I存在时，两个亚稳态的发夹探针A和B在常温下均能够稳定存在，不会将彼此的发夹结构打开。当体系中存在引发探针I时，由于I的序列与发夹A中裸露的支点at和茎部的序列互补，A的发夹结构将会被打开，并裸露出b和c两个部分。裸露出的b区域又与发夹探针B中b*部分的序列互补，因此将bt*作为新的支点与A中b杂交，从而打开探针B的发夹结构。由于发夹探针A和B的互补序列比引发探针I中的互15 西南大学硕士学位论文补序列更长，因此形成A-B互补的双链结构，从而将引发探针I给置换下来。置换下来的I又能与新的发夹探针A杂交进入下一个循环，从而反复不断的形成A-B互补双链实现目标物的循环放大。图1.16CHA的反应机理示意图[37]Fig1.16Programmingbiomolecularself-assemblypathways.Copyright2008NaturePublishingGroup.图1.17基于CHA的电化学传感器用于凝血酶的检测[38]Fig.1.17Schematicillustrationofanovelratiometricelectrochemicalaptasensorforthrombindetectionbasedontargetcatalyzedhairpinassemblystrategy.Copyright2015Elsevier.Gao等[38]利用目标物引发的CHA构建了一个比率法的电化学适体传感器用于凝血酶的检测。如图1.17所示，目标物凝血酶分子能够与发夹H1中的适体序列特异性结合，将H1的发夹结构打开并裸露其引发序列。通过H1上的引发序列诱导电极表面的CHA反应，将发夹H1固载在电极表面，从而使H2上修饰的电子媒介体MB远离电极表面，H1上修饰的电子媒介体Fc靠近电极表面，得到减小的MB信号和增强的Fc信号，通过两种信号变化的比率实现对目标物的定量检测，其检测限达41fmol∙L-1。Zhang等[39]基于CHA放大技术构建了高灵敏、高特异性的电化学生物传感器用于检测miRNA。如图1.18所示，首先设计了两个发夹型的DNA探针H1和H2，在目标物miRNA存在条件下，通过核酸间竞争反应引发两条发夹间的CHA以实现目标物的循环放大。将CHA放大过程中生成的H1-H2双16 第1章绪论链DNA引入到电极表面，通过biotin与SA间的识别作用，将碱性磷酸酯酶固载于电极表面，利用碱性磷酸酯酶催化底物α-萘磷酸盐产生的电化学信号，从而实现对miRNA的定量检测，其检测限为0.6pmol∙L-1。图1.18基于CHA放大技术构建的电化学生物传感器用于miRNA的检测[39]Fig.1.18SchematicrepresentationofmiRNAelectrochemicaldetectionbasedonmismatchedcatalytichairpinassemblyamplification.Copyright2015Elsevier.1.3.3.2杂交链式反应放大技术杂交链式反应（Hybridizationchainreaction），最早是由Pierce和Dirks[40]在2004年提出的一种高效的核酸放大方法。在HCR反应体系中，以一条单链为启动探针，核酸间的竞争性杂交为能量来源，诱发两条发夹结构交互杂交，形成长度不等的亚稳态核酸双链结构。其原理如图1.19所示[41]，在没有启动探针I存在时，由于H1和H2中不存在互补的粘性末端且各自的发夹结构茎部有较多的互补碱基对，二者在常温下均能够稳定存在，不会打开彼此的发夹结构。当启动探针I存在时，启动探针I与H1中的粘性末端a和茎部互补杂交，从而将H1的发夹结构打开释放出cb*序列。裸露出的cb*序列能够与H2中的c*b序列杂交，将H2的发夹结构打开，释放出与启动探针相同的a*b*序列。a*b*序列将会打开新的H1，实现H1与H2间的不断交互杂交，形成带有缺口的核酸双链聚合物，实现目标物的放大。与PCR不同，HCR扩增是由两种寡核苷酸片段连续拼接而形成与目的片段相关的核酸双链聚合物，而不是核酸的目的片段序列。因此，可以通过对发夹探针的信号物质标记或双链结构中嵌入信号物质，实现对核酸、生物分子及金属离子等物质的放大检测。此外，形成的核酸双链结构可作为药物载体，用于药物的靶向释放和靶向治疗研究。17 西南大学硕士学位论文图1.19HCR的反应机理示意图[41]Fig.1.19Principlesofthetarget-triggeredisothermalautonomoushybridizationchainreactionusingthecross-openingoftwohairpinstructures.Copyright2014ACS.图1.20基于HCR放大技术构建的生物传感器用于谷胱甘肽的检测[42]Fig.1.20SchematicillustrationoftheelectrochemicalbiosensorforGSHdetectionbasedonHg2+assistantHCRsignalamplification.Copyright2016Elsevier.Wang等[42]利用Hg2+诱发的HCR信号放大技术构建了一个电化学生物传感器用于谷胱甘肽（GSH）的检测。如图1.20所示，在没有GSH存在时，核酸探针Probe1通过T-Hg2+-T的配位化学作用折叠形成一个发夹结构探针，此时不会诱发HCR反应，电化学活性物质[Ru(NH3+3)6]无法被固载在电极表面，仅有较弱的电化学信号产生。当GSH存在时，GSH能够与发夹结构探针Probe1中的Hg2+鳌合，释放出单链的Probe1。释放出来的Probe1能够将金电极表面的发夹探针打开，诱发HP1和HP2间的HCR反应，在电极表面形成双链的DNA聚合物。将具有电化学活性的[Ru(NH3+3)6]嵌入DNA双链结构中，得到显著增强的电化学信号实现GSH的高灵敏检测，其检测限达0.6nmol∙L-1。18 第1章绪论Miao等[43]通过目标miRNA与电极上的DNA四面体作用，将核酸修饰的AuNPs复合物固载于电极表面，进一步利用AuNPs颗粒上的DNA探针引发HCR反应，实现对miRNA的放大检测。其原理如图1.21所示，该体系首先在金电极表面组装侧链带有发夹型探针的DNA四面体，利用目标miRNA与DNA四面体上发夹型探针的识别作用，将其发夹结构打开暴露出茎部序列。该序列能够与AuNPs复合物上的DNA探针杂交互补，从而将AuNPs复合物固载于电极表面。以AuNPs复合物上的DNA探针作为引物诱导HCR反应，从而将大量的银纳米颗粒（AgNPs）固载于电极表面，实现对miRNA的放大检测。图1.21基于双重信号放大技术的电化学生物传感器用于miRNA的检测[43]Fig.1.21IllustrationofthedualsignalamplificationelectrochemicalmethodformicroRNAassay.Copyright2015RSC.此外，Hong等[44]基于核酸酶辅助的目标物循环和HCR诱导信号放大策略构建了超灵敏的电化学生物传感器用于Hg2+检测。其原理如图1.22所示，首先在电极表面固载发夹型的DNA探针PA，该探针能够通过T-Hg2+-T配位与DNA探针PB部分杂交互补形成双链结构。此时，核酸内切酶ExoIII的剪切活性被激活，对形成的双链DNA特异性的剪切释放出目标物Hg2+。探针PA剪切剩下的片段可作为引发探针诱导MB标记的DNA链S1与S2之间的HCR反应，从而将MB固载于电极表面，实现对Hg2+的定量检测。19 西南大学硕士学位论文图1.22基于HCR放大技术构建的电化学生物传感器用于Hg2+的检测[44]Fig.1.22SchematicdiagramofelectrochemicalsensorforthedetectionofHg2+basedonHCRamplificationstrategy.Copyright2017Elsevier.1.4本研究论文的构思近年来，DNA放大技术得到了快速发展，因其转化效率高、稳定性好、简单、易合成等优点，在生物传感领域起着重要作用。然而，利用单一的DNA放大技术构建的电化学生物传感器受到其信号增益和检测灵敏度的限制，已满足不了生物分析和临床诊断的需求。因此，合理的运用DNA放大技术，将两个或者更多的信号放大策略相结合，已成为构建高灵敏的生物传感器的有效途径。本文结合电化学的不同检测模式，设计了不同的DNA放大策略，用于构建操作简单、高灵敏、高选择、低成本的电化学生物传感器，实现对肿瘤标志物及重金属离子（Hg2+、Pb2+）的高灵敏检测，为临床诊断和环境监测提供新的方法。基于此，结合本课题组的基础研究，本文开展了如下三个方面的工作：（1）碱性磷酸酯酶作为酶免疫分析中一种重要的标记酶，能够催化水解磷酸化底物以除去其磷酸基团。在电化学分析检测中，常用于催化非活性或低活性的底物生成具有电活性的产物用于定量分析。在传统的分析检测中，人们只着眼于ALP催化产生的电活性底物，而忽略可其副产物PO3-3-4。PO4在酸性条件下能够与钼酸盐反应生成具有电化学活性且不溶于水的磷钼酸盐。由于磷钼酸盐具有良好的物理化学性质，使其成为一种良好的电化学电子媒介体，用于构建电化学生物传感器。因此，本工作将CHA循环放大技术和纳米材料放大技术相结合，用于增加ALP固载量，利用ALP催化底物原位生成的PMo3-12O40作电活性物质以实现miRNA-155灵敏检测。本方法能够有效的增强电化学响应信号、简化传感器的制20 第1章绪论备流程，克服了传统电化学生物传感器信号物质固载量低的缺点，实现了对miRNA-155的高灵敏、高特异性检测。（2）DNA在细胞中只与少量的碱土金属相作用，其中，Hg2+因其能够与错配的胸腺嘧啶相互作用形成T-Hg2+-T结构，在生物传感领域受到广大科研工作者的青睐。将T-Hg2+-T配位化学与金属离子特异性DNAzyme相结合，不仅能够实现目标物的高选择，同时还可以诱发目标物的循环放大。此外，HCR是一种无酶的DNA自组装技术，由一条单链DNA即可引发核酸间的竞争性杂交形成核酸间的双链结构。因此，本方案试图将以上的核酸特异性识别及放大技术相结合，利用HCR反应中的核酸竞争性杂交，在电极表面组装一层不导电的DNA水凝胶薄膜，用以阻碍溶液中的氧化还原探针向电极表面扩散，构建电化学阻抗生物传感器用于Hg2+的高灵敏检测。（3）RCA是一种高效的核酸扩增技术，能够在一次聚合延伸过程中得到串联的多个模板序列的拷贝数。通过对扩增出来的重复序列的标记，可实现对目标物的放大检测。在金属离子的分析检测中，金属离子无法直接作为引物用于诱发RCA，因此常借助金属离子特异性的DNAzyme，将目标物转化为DNA片段用作RCA的引物序列。在传统的分析检测中，常将Pb2+特异性识别的DNAzyme链8-17DNAzyme或GR-5DNAzyme作为分子识别元件用于诱发核酸的滚环扩增反应。然而，很少有人注意到这两条Pb2+-DNAzyme能够在相同的条件下剪切同一条底物链。因此，本方案试图采用这两条双重Pb2+-DNAzyme介导两条不同路径的RCA过程，构建一种新型的反馈扩增策略用于高灵敏检测Pb2+。此外，本文还提出了一种简单、高效的方法用于构建碳纤维微电极。将石蜡密为一种新颖的“密封剂”将碳纤维密封到玻璃毛细管中，可实现碳纤维的稳定固载、有效绝缘以及长度的可控。通过与商用的微量移液管组合，构建了一个微型化的电化学检测系统，将试样的样品体积降低至10μL。该方法构建的反馈放大策略具有较高的选择性和灵敏度，同时构建的微型化电化学检测系统不仅简单、成本低、分析测试快，而且具有良好的稳定性和重现性，能够实现对Pb2+的高灵敏检测。21 西南大学硕士学位论文第2章基于CHA和ALP原位催化形成磷钼酸盐构建免标记的电化学生物传感器用于microRNA-155检测2.1引言MicroRNA（miRNA）是一类长度约18~25个核苷酸的短链、非编码的RNA，通过抑制目标mRNA的转录或降解而在调控基因表达中发挥重要作用[45,46]。大量研究表明，miRNA与许多人类疾病的发病机制有关，如癌症[47,48]，心血管疾[49,50]，免疫性疾病[51,52]和淋巴细胞性白血病[53]等，使得miRNA成为了疾病诊断和治疗的前沿性生物标志物之一[54,55]。然而，由于miRNA自身含量低、链短，使其在传统的分析方法中，如逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）[56]，微阵列[57]和Northern印迹[58]难以实现定量检测。另外，上述方法有昂贵的试剂、流程复杂和样品制备耗时等缺陷[59]，因此迫切需要研发一种高灵敏、高特异性、简单便捷的方法来实现miRNA的定量检测。要实现这个目标，选择有效的分析技术至关重要。电化学分析方法由于其自身成本低、简单、检测快速和灵敏度高等优点受到了科研工作者的高度重视[60,61]。然而，在传统的电化学检测方法中，通常需要标记氧化还原信号探针以获得电化学响应信号，不可避免地增加了操作的复杂性和延长了分析时间，甚至还有可能污染分析试样。利用原位生成的氧化还原物质作为电子媒介体，是克服上述缺点的有效途径。近年来，尽管有大量使用碱性磷酸酯酶（ALP）催化1-萘磷酸钠（NPP）生成1-萘酚（NP）用做电化学信号物质的报道[62-65]。然而这些报道中，NP需要扩散到电极表面进一步氧化才能产生电化学信号，这无疑会削弱信号强度并降低灵敏度。在我们之前的工作中，提出了利用环介导等温扩增（LAMP）过程中产生的磷酸根离子（PO3-3-4）原位生成磷钼酸盐（PMo12O40），并将其作为氧化还原电子媒介体构建免标记的电化学生物传感器[66]。该方法利用副产物原位生成电化学信号物质，为我们在电化学的分析检测中提供了一种新的方法。此外，将PO3-4作为ALP催化NPP的副产物原位生成PMo3-12O40用于miRNA的检测目前还未见报道。近年来，核酸扩增技术已经发展成为一种有效的信号放大技术，通过对靶序列的扩增和响应信号的增强，能够大幅度的提高传感器的灵敏度。在过去的几年里，将电化学方法与核酸扩增技术，如杂交链式反应（HCR）[67,68]，滚环扩增反应（RCA）[69,70]，链置换扩增反应（SDA）[71,72]和催化发夹自组装（CHA）[73,74]相结合的生物传感器已被广泛报道。其中，CHA作为一种无酶的放大技术，因其成本低廉、操作流程简单及放大效果好等优点，受到广大科研工作者的青睐。基于此，本体系主要是利用PO3-3-4诱导原位生成的PMo12O40作为电子介体与CHA扩增技术相结合，构建了一个高灵敏的电化学生物传感器用于miRNA-15522 第2章基于CHA和原位形成磷钼酸盐构建免标记的电化学生物传感器用于microRNA检测检测。首先，将氨基化的聚苯乙烯磁性微球（PSC-NH2）与金纳米颗粒（AuNPs）相结合形成AuNPs包裹PSC的复合材料（PSC@AuNPs）作为纳米载体。接着，将ALP和链霉亲和素（SA）孵育在PSC@AuNPs上形成的ALP-PSC@AuNPs-SA生物复合物用作信号探针。随后，在羧基化多壁碳纳米管（MWCNT-COOH）修饰的电极表面沉积一层铂纳米颗粒（PtNPs）以捕获发夹探针（H1）。当目标物miRNA-155存在时，H1的发夹结构将会被打开并将其隐藏的序列暴露出来以便进一步的杂交。当biotin标记的发夹探针H2（bio-H2）存在时，H1的隐藏序列与bio-H2杂交互补，并通过竞争反应将目标序列置换下来，参与下一个杂交过程。通过此目标循环放大，在电极表面则形成大量的bio-H2/H1双链结构。随后，利用biotin和SA之间的特异性识别作用，将ALP-PSC@AuNPs-SA生物复合物固载在电极表面。当在电极表面引入底物NPP时，ALP能够有效地催化水解NPP产生PO3-4。在酸性条件下，产生的PO3-4将进一步与钼酸钠反应，原位生成具有电化学活性的PMo3-3-12O40，它能够稳定地附着到MWCNTs修饰的电极表面。利用PMo12O40自身的多对可逆氧化还原电对，即可产生强而稳定的电化学信号，实现对目标物的定量检测。上述的生物传感器的检测原理如图2.1所示。图2.1电化学生物传感器的构建过程及miRNA-155检测的示意图Fig.2.1SchematicillustrationoftheelectrochemicalbiosensorbasedoninsituformationofPMo12O403-formiRNA-155detection.23 西南大学硕士学位论文2.2实验部分2.2.1材料和试剂柠檬酸钠（C6H5Na3O7·2H2O），链霉亲和素（SA），己硫醇（96％，HT），氯金酸（HAuCl4）和氯铂酸（H2PtCl6）均由Sigma-Aldrich（St，Louis，MO，U.S.A）提供。1-萘基磷酸钠（NPP）购买于江莱生物有限公司（中国，上海）。氨基化的聚苯乙烯磁性微球（PSC-NH2）购于天津倍思乐色谱技术开发中心（中国，天津）。多壁碳纳米管（纯度>95％，MWCNT）由中国科学院成都有机化学有限公司（中国，成都）提供。碱性磷酸酯酶（ALP，1000U）购买于北京博迈斯生物技术有限公司（中国，北京）。本实验中所使用的缓冲溶液如下：20mmol∙L-1Tris-HCl杂交缓冲液为140mmol∙L-1NaCl，5mmol∙L-1KCl，1mmol∙L-1CaCl-12和1mmol∙LMgCl2，pH7.4。5×TBE缓冲液：445mmol∙L-1Tris碱，445mmol∙L-1硼酸，10mmol∙L-1EDTA（pH8.0）。电解液为0.25mol∙L-1H2SO4溶液，且整个实验过程中水均为超纯水（18MΩ∙cm）。实验中所涉及到的寡核苷酸序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司（中国，上海）合成，无需进一步纯化，如表2.1所示。表2.1实验所使用的寡核苷酸序列Table2.1SequenceoftheusedoligonucleotidesinthisworkNameSequence(5′→3′)TAATCGTGATAGGGGTATGGACATGGAACCCCTATCACGATTAGChairpinprobeH1ATTAAAGA-NH2ATGGACATGGATAATCGTGATAGGGGTTCCATGTCCATACCCCTAhairpinprobeH2TGAAGGAGCGACT-BiotinmiRNA-155UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUone-basemismatchedUUAAGGCUAAUCGUGAUAGGGGUmiRNA-155miRNA-21UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGAmiRNA-141UAACACUGUCUGGUAAAGAUGGmiRNA-199AACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA2.2.2仪器和测量纳米材料的形貌分别用扫描电子显微镜（SEM，S-4800，日立，日本）和透射电子显微镜（TEM，JEM-1200EX，日本）进行表征。溶液的pH值采用pH计（PHS-3C，上海雷磁仪器有限公司，中国）进行调节。所有的电化学测量，包括循环伏安法（CV）和差分脉冲伏安法（DPV）均是在CHI660E电化学工作站（上海辰华仪器有限公司，中国）上进行的。采用的是常规三电极体系：直径为4mm24 第2章基于CHA和原位形成磷钼酸盐构建免标记的电化学生物传感器用于microRNA检测的玻碳电极（GCE）为工作电极，铂丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。2.2.3羧基化多壁碳纳米管的制备首先，将MWCNT在40mL体积比为1:3的浓H2SO4：浓HNO3的混合溶液中于100°C回流2h。随后，将上述的反应混合液离心分离并用超纯水反复清洗，直至上层溶液的pH值为中性。紧接着，将清洗后的MWCNT放置于100°C的真空干燥箱中干燥。最后，取1.5mgMWCNT（若无特殊说明，下文均用MWCNT代表羧基化MWCNT）超声分散在2mL超纯水中，以得到均匀溶液供进一步使用。2.2.4ALP-PSC@AuNPs-SA生物复合物的制备首先，根据文献报道的方法用柠檬酸钠还原氯金酸溶液合成AuNPs[75]。然后移取0.5mL5mg∙mL-1的PSC-NH2进行磁分离并用超纯水洗涤三次。接着，将3mL已制备好的AuNPs加入清洗好的PSC-NH2中孵育1h。随后，用磁铁收集已制备好的PSC@AuNPs纳米复合材料，并再次分散在1mL的Tris-HCl（pH7.4）中。然后，将0.3mL摩尔比为50：1的ALP和SA混合溶液加入到已制备好的PSC@AuNPs溶液中，并在4°C180rpm下孵育12h。利用Au-N键，将大量的ALP和SA固载在PSC@AuNPs纳米复合材料表面，以获得ALP-PSC@AuNPs-SA复合物。2.2.5电化学生物传感器的制备在制备传感器之前，实验中所涉及的发夹DNA探针均需在95°C下退火5min后，缓慢冷却至室温形成稳定的发夹结构备用。首先，将玻碳电极分别用0.3μm和0.05μm氧化铝粉末打磨抛光，并用超纯水彻底清洗。再分别经过超纯水、无水乙醇、超纯水超声处理后，将10μL分散的MWCNT（0.75mg∙mL-1）滴加到GCE表面并在37°C下干燥。随后，将MWCNT修饰的电极浸入H2PtCl6溶液（1%，w/w）中，在-0.25V的电位下电沉积40s，以在电极表面获得一层PtNPs。之后，将15μL2μmol∙L-1的H1溶液滴加到PtNPs/MWCNTs修饰电极的表面，在室温下孵育过夜，以在电极表面组装一层H1探针。然后，用超纯水清洗电极并用10μL1.0mmol∙L-1的HT封闭40min，以除去电极表面的非特异性吸附的H1和封闭空余位点。接着，将含有15μL2μmol∙L-1的bio-H2和10μL不同浓度的目标miRNA的混合溶液滴加到电极表面，在37°C下孵育2h进行CHA反应。最后，将10μLALP-PSC@AuNPs-SA复合物滴加到清洗好的电极表面，在室温下孵育40min后，放置于4°C备用。25 西南大学硕士学位论文2.2.6miRNA-155的检测将10μL8mg∙mL-1的NPP溶液滴加到已制备好的电极上，在室温下孵育8min。接着，将10μL50mmol∙L-1的Na-12MoO4和2μL0.5mol∙L的H2SO4分别滴加到电极表面，孵育8min后，将电极放在2mL0.25mol∙L-1的H2SO4溶液中进行DPV检测，其参数设定为：初始电位为-0.05V，最终电位为0.6V，振幅为0.05V，脉冲为0.05s，样品宽度为0.0167s。2.2.7聚丙烯酰胺凝胶电泳表征首先，将H1，H2，H1与H2的混合液，H1、H2和miRNA-155的混合溶液在37°C下孵育2h。接着，将样品分别加入新制的聚丙烯酰胺凝胶（16％）凹槽中，然后凝胶电泳实验在1×TBE缓冲液中120V条件下进行120min。最后，用溴化乙锭染色30min并在紫外光下用数码相机记录凝胶电泳图像。2.3结果与讨论2.3.1CHA过程的凝胶电泳表征采用16%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析CHA放大策略的可行性。如图2.2所示，泳道1-4分别是H1，H2，H1和H2的混合物以及CHA扩增产物。在泳道1和2中可以清楚的看到两条明亮的条带，分别对应于H1和H2。当混合溶液中仅有H1和H2时，在泳道3中出现了两条清晰的条带，分别与泳道1和2中的条带相匹，说明在没有目标物miRNA-155存在时，H1和H2不会发生反应。相反，当H1和H2的混合物中孵育有miRNA-155时，在泳道4出现了一条分子量相对较高的条带，表明只有当miRNA-155存在时，才能诱发CHA形成H1-H2杂交双链。图2.2CHA过程的凝胶电泳分析Fig.2.2Gelelectrophoresisanalysisofdifferentsamples:Lane1,H1;Lane2,H2;Lane3,amixtureofH1and4H2;Lane4,theamplificationproductbyCHA.26 第2章基于CHA和原位形成磷钼酸盐构建免标记的电化学生物传感器用于microRNA检测2.3.2MWCNTs及AuNPs的表征利用SEM和TEM分别对MWCNTs和AuNPs的形貌、尺寸进行了表征。如图2.3A所示，短管的碳纳米管结构表明羧基化MWCNTs的制备是成功的。从图2.3B中可以看出AuNPs的粒径均匀，其平均直径约16nm，表明了AuNPs的成功制备。图2.3（A）MWCNTs的SEM表征图；（B）AuNPs的TEM表征图Fig.2.3(A)SEMimageofMWCNTs;(B)TEMimageofAuNPs.2.3.3电化学传感器的CV表征CV表征是在2mL5mmol∙L-1的[Fe(CN)3-/4--16]溶液（含有0.1mol∙LKCl）中进行，用于记录电化学传感器的逐步制备过程，其电势范围为-0.2V至0.6V，扫速为100mV/s。如图2.4A所示，曲线a是裸GCE的CV曲线。当MWCNTs修饰在电极表面时，由于MWCNTs自身良好的电子传递能力，所以MWCNTs修饰的电极的峰电流急剧增加（曲线b）。由于PtNPs也能促进电子传递，所以当电极表面沉积有PtNPs后，峰电流进一步增加（曲线c）。然而当带负电荷的H1组装在电极表面后峰电流明显降低（曲线d），这主要是因为H1磷酸骨架上的负电荷对[Fe(CN)3-/4-6]的静电排斥和发夹结构的空间位阻引起的。当用不导电的HT封闭电极表面上的非特异性位点时，峰电流再次降低（曲线e）。随着H2和miRNA-155的引入，在电极表面形成了大量的DNA双链，导致[Fe(CN)3-/4-6]的扩散过程被进一步的阻碍，最终使电化学响应信号进一步的降低（曲线f）。当在电极表面固载有ALP-PSC@AuNPs-SA复合物后，CV曲线略微增加（曲线g），说明ALP-PSC@AuNPs-SA复合物成功的固载到电极上。27 西南大学硕士学位论文图2.4（A）电化学传感器的CV逐步表征曲线；（B）PMo12O403-在电极表面形成前（曲线a）和形成后（曲线b）的DPV响应曲线。Fig.2.4(A)CVresponsesofeachmodifiedstepin5mmol∙L-1[Fe(CN)6]3-/4-solutioncontaining0.1mol∙L-1KCl:(a)bareGCE,(b)GCE/MWCNTs,(c)GCE/MWCNTs/PtNPs,(d)H1modifiedelectrode,(e)blockingwithHT,(f)introducingofCHA,and(g)afterincubationwithALP-PSC@AuNPs-SAbioconjugates.(B)DPVresponsesoftheproposedbiosensor:before(a)andafter(b)theformationofPMo12O403-,respectively.2.3.4PMo3-12O40形成的表征及验证为了验证电流信号是由PMo3-3-12O40产生的，本文通过对电极表面PMo12O40形成前后的电流信号的变化进行了比较。如图2.4B所示，当电极表面仅固载有ALP-PSC@AuNPs-SA生物复合物时，并未检测到明显的氧化还原曲线（曲线a）。而当固载有ALP-PSC@AuNPs-SA生物复合物的电极表面孵育上NPP，Na2MoO4和H2SO4后，在0.13V和0.32V的电位下可以清楚地观察到两个信号峰（曲线b）。结果表明电化学响应信号是由PMo3-12O40产生的，这个实验结果与之前的报道的一致[76]。其电子转移方程式如下所示，两对氧化还原峰分别对应于PMo3-12O40和HVVI3-2PMo2Mo10O40之间的两个电子连续转移的过程，该结果与已报道的文献一致[66,77]。28 第2章基于CHA和原位形成磷钼酸盐构建免标记的电化学生物传感器用于microRNA检测2.3.5电化学传感器的条件的优化为了得到检测体系的最佳分析性能，本文分别对H2SO4电解液的浓度，底物NPP的浓度和孵育时间以及PMo3-12O40的沉积时间等重要实验参数进行了优化。由于电流的响应信号强弱与电解液的浓度密切相关，因此对不同浓度的H2SO4电解液对检测信号的影响进行了研究。如图2.5A所示，当H-12SO4的浓度为0.25mol∙L时，在0.32V可以观察到最佳的电化学相应信号，故将0.25mol∙L-1的H2SO4作为电解液的最佳浓度。本实验中的电化学信号是由PMo3-12O40的电子转移产生的，其主要来源于ALP与NPP的水解产物在酸性条件下与Na2MoO4反应生成。因此，NPP浓度是影响电化学信号的重要参数之一，其NPP浓度与电化学信号响应之间的关系如图2.5B所示。随着NPP浓度从4mg∙mL-1增加到8mg∙mL-1，电流信号逐渐增加。然而，当NPP浓度超过8mg∙mL-1时，电流信号显著下降。因此，在本研究中将8mg∙mL-1作为NPP的最优浓度。图2.5电化学传感器对不同的实验条件的响应：（A）底液H2SO4的浓度；（B）底物NPP的浓度；（C）ALP催化时间；（D）PMo12O403-沉积时间。Fig.2.5EffectofdifferentexperimentalparametersontheDPVresponsesoftheproposedbiosensor:(A)TheconcentrationofH2SO4.(B)TheconcentrationofsubstrateNPP;(C)ThetimeofALPenzymecatalysis;(D)ThedepositiontimeofPMo3-12O40.29 西南大学硕士学位论文在ALP催化水解非活性底物NPP产生PO3-4的过程中，其反应时间与电化学信号的强弱息息相关，因此本实验对NPP在电极表面的孵育时间进行了优化。如图2.5C所示，当NPP孵育在电极表面时，电化学响应信号迅速增强，在8min后逐渐趋于稳定，故将8min作为ALP催化NPP的最佳催化时间。此外，PMo3-12O40的沉积时间也是影响电化学信号强弱以及稳定性的重要因素之一。从图2.5D中可以看出，随着沉积时间的延长，越来越多的PMo3-12O40富集在电极表面，导致电流信号逐渐增大。当沉积时间超过8min，生成的PMo3-12O40基本完全吸附在电极表面，因此电流信号增加较少，故将8min作为PMo3-12O40最佳沉积时间。2.3.6ALP和PSC对电化学信号的影响为研究ALP对电化学信号的影响，本实验对该传感器在有无ALP情况下的电化学信号的强弱进行了研究，其增强的效果可通过峰电流变化的大小（ΔI）来进行评估。如图2.6A所示，当体系中没有ALP时，在0.32V处只能观察到微弱的电化学信号（曲线a）。相反，当电极表面固载有ALP时，可以观察到电化学信号的显著增强（曲线b），其峰电流变化ΔI值为172.8μA，表明ALP在信号的产生和放大中起着关键性作用。同时，本文还对不同纳米载体对电化学信号的影响进行了研究。如图2.6B所示，采用PSC@AuNPs做纳米载体的响应电流明显高于AuNPs作为纳米载体的修饰电极，其峰电流变化ΔI值为81.1μA。说明PSC@AuNPs纳米复合物具有更大的比表面积，能够负载更多的ALP从而显著增强电化学响应信号。图2.6（A）电化学传感器中ALP对信号放大的影响；（B）电化学传感器中以AuNPs和PSC@AuNPs做为纳米载体对电化学信号的影响。Fig.2.6(A)ComparisonofthecurrentchangeoftheelectrochemicalbiosensorwithoutALP(a)andwithALP(b);(B)DPVresponsesoftheproposedbiosensormodifiedwithdifferentnanocarriers:AuNPs(a),andPSC@AuNPs(b).30 第2章基于CHA和原位形成磷钼酸盐构建免标记的电化学生物传感器用于microRNA检测2.3.7.传感器对miRNA-155的检测性能在最优实验条件下，将上述电化学生物传感器用于检测一系列不同浓度的miRNA-155，以评估该传感器的检测性能。从图2.7A中可以看出，在10fmol∙L-1至1nmol∙L-1范围内，电化学响应信号随着miRNA-155浓度的增加而增加，在0.32V处的峰电流值与miRNA-155浓度的对数值呈良好的线性关系（图2.7B）。其线性回归方程为I（μA）=32.09lgcmiRNA+324.83，线性相关系数为r=0.9986，检出限为1.64fmol∙L-1。此外，将上述传感器与报道的其它miRNA-155的检测方法比较（表2.2），从表中可以看出本文所设计的电化学生物传感器具有更高的灵敏度和更宽的线性响应范围。图2.7（A）电化学传感器对不同浓度的miRNA-155响应曲线；（B）DPV峰电流与浓度间的线性关系。Fig.2.7(A)DPVresponsesoftheelectrochemicalbiosensortodifferentconcentrationsofmiRNA-155in0.25mol∙L-1H2SO4.(B)Thecalibrationplotsofthecurrentresponseatthepotentialof0.32VversusthelogarithmofmiRNA-155concentration.表2.2传感器与报道的其它miRNA-155的检测方法比较Table2.2ComparisonwithotherworksformiRNAdetection.MethodsLinearrangeDetectionlimitRef.Electrochemiluminescence10fmol∙L-1to100pmol∙L-15.4fmol∙L-178Surfaceplasmaresonance5pmol∙L-1to100nmol∙L-11pmol∙L-179Surfaceplasmaresonance50pmol∙L-1to50nmol∙L-145pmol∙L-180Squarewavevoltammetry50fmol∙L-1to30pmol∙L-112fmol∙L-181Differentialpulsevoltammetry20fmol∙L-1to50pmol∙L-15.36fmol∙L-182Differentialpulsevoltammetry10fmol∙L-1to1nmol∙L-11.64fmol∙L-1ourwork31 西南大学硕士学位论文2.3.8传感器的选择性、重现性和稳定性为验证上述传感器的选择性，在相同条件下对miRNA-21，miRNA-141，miRNA-199A和sRNA等四种类型的miRNA进行了考察。如图2.8A所示，与空白分析试样相比，即使在电极表面孵育20pmol∙L-1的miRNA-21，miRNA-141，miRNA-199A和sRNA，其峰电流也没有明显变化。将上述四种干扰物与2pmol∙L-1miRNA-155混合在孵育到电极表面，可以发现电化学信号显著增加。与电极表面只孵育了2pmol∙L-1的miRNA-155相比，二者峰电流没有明显变化，说明该生物传感器对miRNA-155具有良好的选择性。同时，还对同一批次中的五根不同电极进行了分析以考察该传感器的重现性。如图2.8B所示，5根不同电极的峰电流的变异系数为2.46%，说明该传感器具有良好的重现性。此外，通过采用连续稳态循环伏安法对电极的稳定性进行了考察。如图2.8C所示，经过100次恒电位循环扫描后，电流值与初始响应电流相比仅降低了5.37%，表明该传感器具有优良的稳定性[83]。图2.8（A）传感器的选择性研究;（B）传感器的重现性研究;（C）传感器的稳定性研究Fig.2.8(A)Selectivityofthebiosensortowardsdifferentinterferences.(B)Reproducibilityoftheproposedbiosensorincubatedwith2pmol∙L-1miRNA-155inthesamebatch.(C)StabilityoftheproposedbiosensorundersuccessiveCVscansatthescanrateof100mV/sfor100cycles.32 第2章基于CHA和原位形成磷钼酸盐构建免标记的电化学生物传感器用于microRNA检测2.3.9.传感器在实际样品检测中的应用为考察该传感器在实际样品检测中的可靠性，我们选择了宫颈癌细胞（Hela）和人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）的裂解产物作为实际样品进行了加标回收实验。如图2.9所示，与空白分析物相比，1×102个Hela细胞的裂解产物只引起电化学响应信号的微小增加。即使Hela细胞数增加至1×105个，其电化学信号增加也不明显。相反，当在电极表面孵育1×102个MDA-MB-231细胞的裂解产物时，其电化学信号明显增加。随着MDA-MB-231细胞数量的增加至1×105个，其响应信号显著增加。上述结论表明miRNA-155在MDA-MB-231细胞中高表达，而在Hela细胞中呈低表达或不表达，该实验结果与之前文献的报道一致[85-86]。图2.9传感器在Hela和MDA-MB-231细胞中的实际样品检测Fig.2.9DetectionofmiRNA-155fromHelaandMDA-MB-231celllysates.2.4结论本文基于原位形成的PMo3-12O40和CHA放大技术构建了一个高灵敏的电化学生物传感器用于miRNA-155检测。在本工作中，将CHA放大技术和PSC@AuNPs纳米复合材料相结合，实现了对目标物的循环放大和电化学响应信号的显著增强，极大的提高电化学生物传感器的灵敏度。与传统的电化学检测方法相比，该方法利用ALP催化底物过程中产生的副产物，原位生成具有电化学活性的电子媒介体，直接用于目标物的定量检测，避免了繁琐的标记过程和复杂的操作步骤，同时克服了电极表面电活性物质固载量低的缺点。此外，将MWCNTs用作基底材料，不仅能够增强电极表面的界面电子传递，同时还能将生成的PMo3-12O40电化学信号分子牢固的吸附在电极表面，产生稳定的电化学响应信号，极大提高传感器的稳定性。更重要的是，该方法在实际样品检测中的成功运用，表明该传感器在临床诊断中具有潜在价值。33 西南大学硕士学位论文第3章基于DNAzyme辅助的目标物循环和HCR放大策略构建DNA水凝胶电化学阻抗生物传感器用于Hg2+检测3.1引言汞（Hg）是银白色闪亮的重质液体，被广泛用于机械制造、金属冶炼、电器仪器等领域，因其毒性强、分布广，被认为是一种重要的重金属污染物。据报道，即使相对浓度较低的汞污染物，也能够对人体健康和环境造成严重的危害[87,88]。在过去的几十年里，汞污染一直是世界性关注的难题之一[89]。其中，水溶性的Hg2+是汞污染普遍存在的一种形式，由于其自身能够通过食物链与含有硫的分子结合并富集在人体内，通常也被认为是毒性最强的一种形式[90-92]。美国环保局（EPA）于2001年规定，饮用水中Hg2+的含量不得高于10nmol∙L-1。然而，目前大多数的传感器受其灵敏度的影响，难以达到该检侧要求，因此很难用于Hg2+的实际检测。因此，构建高灵敏的生物传感器用于Hg2+的检测，在食品安全、环境保护和临床毒理学上具有深远意义[93]。在过去的几年中，基于碳纳米材料[94-97]、金属纳米颗粒[98-100]、半导体量子点[101]、聚合材料[102,103]和Ag/Hg合金[104]的荧光和比色传感器用于Hg2+的检测被广泛报道。然而这些传感器大多受到水溶性差，灵敏度低或者选择性差等限制，因此迫切需要设计出高灵敏、高选择的传感器用于Hg2+检测。近年来，利用精细生物元件构建金属离子生物传感器，已逐渐成为一种主要的策略。脱氧核酶（DNAzyme），是一种体外分离、筛选出来的具有催化活性的核酸工具酶。由于其自身的高催化性、多功能性和可设计性，在构建生物传感器上受到了广泛关注[105,106]。其中，金属离子特异性的DNAzyme常作为分子识别元件或信号放大标签，被广泛用于荧光、比色等方法中的DNA[107-109]和重金属离子检测[110-112]。另一种为人熟知的Hg2+检测方法是基于胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶（T-Hg2+-T）的配位化学作用。自Ono等[113]和Miyake等[114]报道了Hg2+对寡核苷酸中的T碱基具有很强的亲和力以来，基于T-Hg2+-T的配位化学常被用作分子识别元件用于构建Hg2+生物传感器。近年来，大量基于DNAzyme、T-Hg2+-T或将T-Hg2+-T耦合于DNAzyme中的荧光检测系统被设计出来。例如，Shimron等[115]构建了一个基于T-Hg2+-T诱导激活的Mg2+-DNAzyme的方法用于Hg2+检测。Li等[116]设计了一个基于T-Hg2+-T诱导形成的三通道的Mg2+-DNAzyme荧光检测平台用于Hg2+检测，其检测限达到了4.5pmol∙L-1。在这些工作的基础上，我们试图利用这些方法与电化学的高灵敏、低成本、检测快、简单等特点相结合，构建一个高灵敏、高选择的电化学生物传感器用于Hg2+检测。DNA水凝胶是一种3D网状的多孔聚合物，其自身含有大量的水份，主要是通过交联核酸修饰的聚合链制备而成的[117,118]。由于其自身的高固载能力、机械稳34 第3章基于DNAzyme辅助的目标物循环和HCR放大策略构建DNA水凝胶电化学阻抗生物传感器用于Hg2+检测定性、可降解和良好的生物相容性及条件应激性，在材料科学上引起了极大地兴趣，被广泛的用于构建功能材料[116,119-120]、生物催化剂[121]、生物医药[122,123]和传感器[105,124-125]。尽管水凝胶的应用已经涉及到了各个领域，但利用水凝胶作为电化学信号放大元件构建电化学检测平台用于金属离子的检测，目前几乎还少有报道。近年来，Gibbs等[126]基于DNA的自组装在电极表面生成了一层二茂铁修饰的DNA聚合杂化物，构建了一个电化学生物传感系统用于DNA的放大检测。Kahn等[127]利用杂交链式反应（HCR）在纳米金修饰的电极表面组装了一层DNA水凝胶，构建了一个电催化薄膜开关。Yang等[128]基于目标物诱导pH应激响应的DNA水凝胶构建了一个阻抗型适体传感器，利用水凝胶对界面电子转移的影响实现了对乙酰肝霉素的检测。受到以上报道的启发，本体系试图利用HCR在电极表面组装一层DNA水凝胶用作信号放大元件，构建一个电化学阻抗型生物传感器用于Hg2+检测。本实验基于Hg2+诱导激活的Mg2+-DNAzyme和修饰在丙烯酰胺聚合物链上的DNA间的HCR反应，在电极表面引入一层不导电的DNA水凝胶用于Hg2+的放大检测。如图3.1B所示，Mg2+-DNAzyme链由子单元DNAD1和D2（粉红色的部分是富含T碱基序列）组成。当加入某一浓度的Hg2+时，D1和D2将会通过T-Hg2+-T配位化学作用结合形成在一起形成Mg2+-DNAzyme的酶链。该酶链能够进一步组装在核糖核酸修饰的发夹型DNA探针H2（H2）的环上，形成不具有催化活性DNAzyme。当Mg2+存在时，Mg2+-DNAzyme的催化活性被激活，Mg2+在特异性识别位点对H2进行剪切，释放出T-Hg2+-T复合物和单链DNA（sDNA）。释放出的T-Hg2+-T复合物又可作用于下一个剪切过程，通过此剪切循环将产生大量的sDNA。当在修饰有发夹型DNA探针H1（H1）的电极表面孵育上述含有sDNA的溶液时，H1的发夹结构会被打开并且裸漏出自身隐藏的核酸序列。H1裸露的核酸序列又可作为启动探针，诱导P1和P2间的HCR反应，从而将丙烯酰胺聚合链层层组装在电极表面形成DNA水凝胶，用以阻碍电极表面的界面电子传递能力。因此，通过耦合DNAzyme辅助的目标物循环和HCR诱导的信号放大，本体系能够实现对Hg2+的精准、灵敏的检测。上述传感器的检测原理如图3.1A所示：35 西南大学硕士学位论文图3.1基于DNA水凝胶构建的电化学阻抗传感器用于Hg2+检测的示意图Fig.3.1SchematicillustrationoftheimpedancebiosensorbasedonDNA-hydrogelforsensitivedetectionofHg2+.3.2实验部分3.2.1材料与试剂三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、氯化镁、氯化钠、氯化钾、氯化钙均由上海泰坦科技有限公司提供。N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸（HEPES），过硫酸铵（APS），N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED），丙烯酰胺溶液（40%）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。三-（2-甲酰乙基）膦盐酸盐（TCEP），6-巯基-1-己醇（MCH），氯化金四水合物（HAuCl4）购买于西格玛奥德里奇（上海，中国）贸易有限公司。汞离子标准溶液由国家有色金属及电子材料分析测试中心（北京，中国）提供。实验中所涉及的其它化学试剂均为分析纯，使用前无需进一步纯化。本实验使用的缓冲液如下所示：结合缓冲液（pH8.0）：10mmol∙L-1Tris-HCl，140mmol∙L-1NaCl，5mmol∙L-1KCl，1mmol∙L-1CaCl-1-12和1mmol∙LMgCl2。修饰缓冲液（pH7.2）：25mmol∙LHEPES和100mmol∙L-1NaCl。HEPES缓冲（pH7.2）:25mmol∙L-1HEPES，1mol∙L-1NaNO3和20mmol∙L-1Mg(Ac)-1-12。HCR缓冲液（pH7.2）:25mmol∙LHEPES和25mmol∙LMgCl-1-12。5×TBE缓冲（pH8.0）:445mmol∙LTris，445mmol∙LH3BO3和1036 第3章基于DNAzyme辅助的目标物循环和HCR放大策略构建DNA水凝胶电化学阻抗生物传感器用于Hg2+检测mmol∙L-1EDTA。电化学阻抗检测缓冲液（E-buffer）：25mmol∙L-1HCR缓冲液和25mmol∙L-1Fe(CN)3-/4-6以1:1的体积比混合。所有的寡核苷酸由生工生物工程（上海）股份有限公司（中国，上海）合成并纯化。如表3.1所示。表3.1本实验所使用的寡核苷酸序列Table3.1Sequencesoftheoligonucleotidesusedinthiswork.NameSequence(5′→3′)D1GATATGAGCGATGTTGTCTTD2TTGTCTTCCCACCCATGTTACTCTH1SH-CTGGACGATATGCCGATTGAGAAGGTGCATATCH2ATTCTGGACACAAGAGTATrAGCATATCGTCCAGAcrydite-TGGTAGGTCAAGGTGCATATGGATGTTAGAGATATGCACCTTH3CTCAATCGTCTAACATCCATATGCACGCGATTGAGAAGGTGCATATGGAGTCTAATH4CGGCGGGTAAAA1Acrydite-TTTACCCGCCGATTAGAC3.2.2仪器与测试DNA水凝胶的形貌由扫描电子显微镜（SEM，S-4800，日立，日本）测得。实验中的所有电化学测试，包括循环伏安法（CV）和电化学交流阻抗（EIS）都是由CHI660E电化学工作站（上海晨华仪器有限公司，中国）所测得。体系中采用的是传统的三电极系统：将直径3mm的玻碳电极（GCE）作为工作电极，铂丝和饱和的Ag/AgCl电极分别为对电极和参比电极。循环伏安法检测是在2mL5mmol∙L-1Fe(CN)3-/4--16（含有0.1mol∙LKCl）的缓冲液中测得，其中扫描范围为-0.2V至0.6V，扫速为50mV/s。电化学阻抗实验是在2mL的E-buffer中所测得，其参数设定为：初始电位为0.272V，振幅为5mV，频率为0.1Hz至105Hz。3.2.3DNA修饰的聚丙烯酰胺复合链的制备聚丙烯酰胺/DNA共聚物的制备过程如图3.1A所示。由于丙烯酰胺只能修饰在DNA的5′末端，因此用一条丙烯酰胺修饰的短链DNA（A1）与发夹探针H4相结合，用于合成聚合物P2。具体的制备过程如下，将20μL100μmol∙L-1的H3和A1分别加入80μL含有2%（质量体积比）的丙烯酰胺的结合缓冲液中，并通入氮气5min，以除去溶液中的溶解氧。随后，在100μL的水溶液加入10mg的APS和5μL的TEMED以制备引发剂，并将刚制备的引发剂按体积比1.4%的量分37 西南大学硕士学位论文别加入到丙烯酰胺-DNA的混合溶液中，继续通氮气5min。然后，将上述混合溶液在4°C放置过夜以便进一步聚合。在聚合反应完成后，将聚合产物P1和PA1分别用30kDa和10kDa超滤离心管过滤，除去溶液中未聚合的DNA链、丙烯酰胺单体、盐和引发剂。接着，将超滤后得到的聚合物用超纯水清洗三次，HCR缓冲液清洗一次后，再将H4按摩尔比1:1加入PA1中，以形成聚合物P2。将形成的P1和P2聚合物在95°C退火5分钟后，立即冰浴30min，使其迅速冷却以确保H3、H4充分形成发夹结构。最后，将制备的得到的聚合物P1和P2放置于4°C备用。3.2.4DNAzyme剪切产物的制备Hg2+诱导Mg2+-DNAzyme，通过Mg2+的剪切作用产生sDNA的反应流程如图3.1B所示，将含有4μmol∙L-1的D1，D2，H2和不同浓度Hg2+的HEPES缓冲溶液在95°C退火5min，并缓慢冷却至室温，以形成Mg2+-DNAzyme结构。随后，将上述反应液储存于4°C备用。3.2.5电化学生物传感器的制备首先将含有4μmol∙L-1巯基修饰的H1和5mmol∙L-1TCEP的修饰缓冲液在室温下孵育30min，以防止修饰的巯基形成二硫键。随后将反应液在95°C下退火5min，并缓慢冷却至室温。接着用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆将GCE打磨、抛光，并用超纯水清洗干净后，再分别用超纯水、乙醇和超纯水超声清洗5min，以得到洁净、平整的电极表面。然后将GCE浸入1%（质量体积比）的HAuCl4溶液中，在-0.2V的电位下电化学沉积30s，以在电极表面获得一层均匀的金纳米颗粒（AuNPs）。紧接着将8μL的H1滴在电极上并在室温下孵育14h，通过金-巯键将H1组装在电极表面。随后，将H1修饰的电极用超纯水清洗三遍，并用8μL2mmol∙L-1的MCH溶液在室温下封闭30min。然后在MCH封闭后的电极表面滴上8μL的DNAzyme水解产物（DHPs），并在37°C孵育2h，以实现sDNA和H1的杂交。最后将8μL的丙烯酰胺聚合物P1和P2等体积混合，迅速滴加于电极表面，在37°C孵育2h以形成DNA水凝胶。3.2.6凝胶电泳分析体系中HCR的可行性采用16%的非变性的聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）进行分析。凝胶电泳试验是在120V的电压下，1×TBE电解液中进行了110min。随后，将凝胶在4SGreenDNA荧光染料中染色30min，用天能-5200多功能化学发光/荧光图像系统进行成像。38 第3章基于DNAzyme辅助的目标物循环和HCR放大策略构建DNA水凝胶电化学阻抗生物传感器用于Hg2+检测3.3结果与讨论3.3.1传感器的电化学表征分别用EIS和CV对传感器的构建和组装过程进行表征。其中，EIS表征数据采用ZSimpWin软件进行拟合，其谱图如图3.2A所示，其内部插图是Randle等效电路图，包含有电子转移阻抗（Rct），电容（Cdl），电解液电阻（Rs）和Warburg元件（Zw）。在Nyquist谱图中，Rct直接由电极表面氧化还原探针的电子转移动力学控制，与谱图中的半圆的直径相对应[129,130]。如图3.2A所示，裸电极只有很小的一个半圆（Rct≈324.2Ω，曲线a），在沉积AuNPs后，半圆直径几乎降成了一条直线（曲线b）。当H1组装在电极上时，半圆的直径增加了许多（Rct≈516Ω，曲线c）。该现象主要是因为带负电荷的发夹探针H1，产生的空间位阻和静电排斥，使[Fe(CN)3-/4-6]难以扩散到电极表面。随着非特异性结合位点被不导电的MCH封闭，半圆的直径进一步的增加（Rct≈876.2Ω，曲线d）。当在电极表面孵育DHPs后，由于DHPs中的sDNA能够与H1杂交形成DNA双链，增加了电极表面的负电荷和空间位阻，使得半圆的直径再次增加（Rct≈1274.4Ω，曲线e）。最后，当丙烯酰胺共聚物孵育在电极表面后，半圆的直径极大增加（Rct≈3186.3Ω，曲线f）。基于此，可以推测HCR在电极表面诱导形成了一层不导电的聚合物薄膜，该薄膜主要是由带负电的双链DNA和丙烯酰胺聚合物组成。图3.2生物传感器在逐步构建过程中的EIS表征（A）和CV表征（B）Fig.3.2EIS(A)andCV(B)characterizesofthebiosensorstepwisefabricationprocess:(a)bareGCE;(b)AuNPs/GCE;(c)H1/AuNPs/GCE;(d)MCH/H1/AuNPs/GCE;(e)sDNAmodifiedelectrode;(f)theformationofDNAhydrogelontheelectrode.CV表征如图3.2B所示，裸电极的CV曲线是一对标准的[Fe(CN)3-/4-6]氧化还原峰（曲线a），而在沉积AuNPs后，峰电流明显的增加（曲线b）。当电负性的H1组装在电极表面时，由于存在空间位阻和静电排斥，峰电流有所降低（曲线c）。当不导电的MCH封闭电极表面的非活性位点后，峰电流持续降低（曲线d）。随39 西南大学硕士学位论文着DHPs中的sDNA与电极表面的H1杂交后，使得电极表面的负电荷和空间位阻增大，峰电流进一步降低（曲线e）。当丙烯酰胺共聚物P1和P2孵育在电极表面形成DNA水凝胶后，峰电流明显降低（曲线f）。该结果与上述EIS的表征结果一致，因此可以初步确认上述基于DNA水凝胶的电化学生物传感器的制备是成功的。3.3.2HCR介导形成DNA水凝胶的可行性研究DNA水凝胶是通过HCR将聚丙烯酰胺聚合链层层组装在电极表面而形成的，故HCR的可行性是形成DNA水凝胶至关重要的因素之一。为了研究HCR的可行性，本体系采用16%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对反应的可行性进行了分析。在开展PAGE实验之前，实验中所涉及的发夹DNA探针需退火处理。如图3.3所示，在新制备凝胶的1-8号泳道中分别加入DHPs、H3、H4/A1、H1、DHPs与H1的杂交产物（HPs1）、HPs1与H3的杂交产物（HPs2，注：H3的用量大于DHPs和H1的用量）、HPs1与H4/A1的杂交产物和HCR产物。可以发现，泳道4中出现了一条清晰的H1条带和一条可忽略的副产物条带。当H1与DHPs以相同浓度混合后，在泳道5中出现了一条清晰整齐的条带，该条带的出现表明了H1的发夹结构被DHPs打开，形成了双链DNA。而在H1和DHPs的混合物中引入H3后，泳道6中出现了一条明亮的条带，其余的条带分别与泳道2和5中的条带一致。然而，即使将高浓度的H4/A1加入到H1与DHPs的混合物中，泳道7中也没有明显的条带生成，说明HPs1中的引发序列不能打开发夹H4。为了说明水凝胶是通过HCR反应生成的，将H3和H4/A1的混合物同时加入H1与DHPs的混合物中，可以发现，在泳道8的顶端出现了几条明亮的条带，说明H3和H4/A1的混合物能够引发HCR。结果表明，该体系中的DNA设计是成功的。图3.3HCR可行性的PAGE分析Fig.3.3GelelectrophoresisanalysisoftheHCRsystem.为了进一步验证DNA水凝胶是通过P1和P2间的HCR组装形成，该体系对40 第3章基于DNAzyme辅助的目标物循环和HCR放大策略构建DNA水凝胶电化学阻抗生物传感器用于Hg2+检测sDNA/AuNPs/GCE表面的不同修饰过程进行了研究。其信号增强的效果可用实验测得的阻抗值与sDNA修饰的电极的阻抗变化值进行评估（ΔRct,ΔRct=R1-R0）。如图3.4所示，与AuNPs/GCE的阻抗值（曲线a，Rct≈1310Ω）相比较，电极上孵育P1以后（曲线b），阻抗值只有少许增加（ΔRct≈530Ω），说明P1上的发夹H3被sDNA上的引发序列打开形成杂交的DNA双链，使少量的聚丙烯酰胺复合物固载在电极表面。当电极表面只孵育P2时，阻抗值没有明显的增加（曲线c，ΔRct≈90Ω），说明P2上的发夹H4不能被sDNA打开。然而，当P1和P2的混合物同时孵育在电极上时，可以发现阻抗值明显的增加（曲线d，ΔRct≈2020Ω），说明通过HCR自组装在电极表面成功的形成了聚丙烯酰胺/DNA共聚物。图3.4sDNA修饰的电极在不同步骤下的Nyquist图Fig.3.4EISofsDNAmodifiedelectrodetowardsdifferentprocess:(a)sDNAmodifiedelectrode,(b)incubatedwithP1,(c)incubatedwithP2,and(d)incubatedwiththemixtureofP1andP2.3.3.3DNA水凝胶的表征利用SEM对DNA水凝胶的形貌进行了表征。由于DNA水凝胶的形成是通过DNA杂交互补将聚丙烯酰胺复合链交联得到的，其自身含有大量的纳米水滴。为了得到多孔的网状结构，需将将新鲜制备的DNA水凝胶放在洁净的硅片上，经过液氮冷冻和真空干燥，将产生的冰晶升华掉。如图3.5所示，经过冻干后，可以明显的看到不规则的多孔网状结构，表明DNA水凝胶的成功制备。图3.5DNA水凝胶的SEM图Fig.3.5Freeze-driedSEMimageoftheDNAhydrogel.41 西南大学硕士学位论文3.3.4DNA水凝胶对电化学信号放大的作用为了探究DNA水凝胶对电化学信号的贡献值，本实验采用不同放大策略对sDNA修饰的电极进行处理，将其测量的结果与sDNA修饰电极的阻抗值比较，以评估不同放大策略的增益效果（ΔRct=R1-R0）。如图3.6所示，sDNA修饰的电极的阻抗值约为1230Ω（曲线a）。当H3与H4/A1的混合物孵育在sDNA修饰的电极上，阻抗值只有少量增加（ΔRct≈1010Ω，图3.6A）。然而当P1和P2的混合物孵育在电极表面时，阻抗值明显增加（ΔRct≈2160Ω，图3.6B），该现象说明HCR在电极表面成功的组装了一层DNA水凝胶。上述结果表明，DNA交联的丙烯酰胺水凝胶能够显著增强电化学响应信号。图3.6sDNA修饰的电极表面孵育(A)H3和H4/A1,(B)P1和P2的EIS响应曲线。Fig3.6TheEISresponsesofthesDNAmodifiedelectrodetreatedwith(A)H3andH4/A1,(B)P1andP2,respectively.3.3.5条件优化为了得到得到最佳的分析性能，本实验对HCR的反应时间进行了优化。图3.7展示了不同的HCR反应时间对电化学信号的影响。从图中可以看出，随着杂交反应时间的延长，阻抗值逐渐增大。然而，当反应时间超过120min后，阻抗值没有明显的变化，因此在后续的实验中将120min选为HCR的最优反应时间。图3.7HCR杂交反应时间对EIS响应信号的影响Fig.3.7EffectofthehybridizationtimeoftheHCRonthesignalresponse.42 第3章基于DNAzyme辅助的目标物循环和HCR放大策略构建DNA水凝胶电化学阻抗生物传感器用于Hg2+检测3.3.6传感器对Hg2+的分析性能在最优的实验条件下，将上述电化学阻抗生物传感器用于分析一系列不同浓度的Hg2+标准试样，以评价该传感器的分析性能。如图3.8A所示，在0.1pmol∙L-1到10nmol∙L-1范围内，电化学的响应信号随着Hg2+浓度增加而增加。图3.8B给出了其对应的阻抗值与Hg2+浓度对数的标准曲线，线性方程为R2+ct=393.16lgcHg(nmol∙L-1)+3285.30，相关系数为r=0.9985，检出限为0.042pmol∙L-1。此外，本实验还将上述传感器与报道的其它Hg2+的检测方法进行了比较，如表3.2所示。可以看出，上述传感器比已有的检测方法具有更宽的线性范围、更高的灵敏度。图3.8（A）传感器对不同Hg2+浓度的EIS响应曲线；（B）电化学传感器的标准曲线Fig.3.8EISforHg2+detectionatvariousconcentrations:(a)blank;(b)0.1pmol∙L-1;(c)1pmol∙L-1;(d)10pmol∙L-1;(e)100pmol∙L-1;(f)1nmol∙L-1;(g)5nmol∙L-1;(h)10nmol∙L-1.(B)ThelinearrelationshipbetweentheRctandthelogarithmofHg2+concentration.表3.2本体系构建的生物传感器与已报道的用于Hg2+检测的传感器性能比较Table3.2ComparisonwithotherreportedbiosensorsforHg2+detection.MethodsDetectionlimitDetectionrangeRef.Fluorescent0.3nmol∙L-10.3nmol∙L-1-100nmol∙L-194Differentialpulsevoltammetry0.3pmol∙L-110pmol∙L-1-100nmol∙L-1131Differentialpulsevoltammetry2.5pmol∙L-15pmol∙L-1-50mol∙L-1132Differentialpulsevoltammetry0.12pmol∙L-10.2pmol∙L-1-35nmol∙L-1133EIS0.4pmol∙L-11pmol∙L-1-100nmol∙L-1134EIS0.042pmol∙L-10.1pmol∙L-1-10nmol∙L-1Ourwork43 西南大学硕士学位论文3.3.7重现性和选择性为研究上述的传感器的重现性和准确性，本体系对批间和批内的不同Hg2+的浓度（如1pmol∙L-1,10pmol∙L-1和100pmol∙L-1）进行了检测。结果表明，在上面提到的三个浓度中，批间相对标准偏差（RSD）为7.8%,7.4%,6.8%，批内为5.6%,4.9%,4.1%(n=3)，说明该传感器具有较好的重现性和准确性。同时，用环境中普遍存在的金属离子（如Ag+，Mn2+，Al3+，Ba2+，Cu2+，Co2+，Cd2+，Ni2+和Fe3+）来代替Hg2+，以评价该传感器对Hg2+的选择性。如图3.9所示，与空白实验相比，1nmol∙L-1的Hg2+使阻抗值明显增加，而其他的干扰金属离子即使在高浓度下（10nmol∙L-1）也只引起了极小变化，说明该传感器对Hg2+具有良好的选择性。图3.9阻抗传感器对不同干扰离子的选择性Fig.3.9Selectivityoftheimpedimetricsensortowardsdifferentinterferences:Ag+,Mn2+,Al3+,Ba2+,Cu2+,Co2+,Cd2+,Ni2+andFe3+.Theconcentrationofeachmetalionwas10nmol∙L-1.3.3.8实际样品检测在实验室自来水水样中加入不同浓度的Hg2+标准溶液，进行加标回收实验，以研究该传感器的实际应用能力。其结果如表3.3所示，回收率和RSD分别为95.2%到103.3%和3.2到6.8%(n=3)，表明该传感器具有较高的准确度，能够初步用于自来水水样检测。表3.3传感器在饮水样品中的回收实验Table3.3Recoveryexperimentsoftheproposedbiosensorindrinkingwatersamples(n=3).SamplesHg2+spiked(mol∙L-1)Hg2+recovered(mol∙L-1)Recovery(%)RSD(%)12×10-121.904×10-1295.23.222×10-112.025×10-11101.36.832×10-102.047×10-10102.44.845×10-104.904×10-1098.15.151×10-91.033×10-10103.36.544 第3章基于DNAzyme辅助的目标物循环和HCR放大策略构建DNA水凝胶电化学阻抗生物传感器用于Hg2+检测3.4结论本体系将DNAzyme介导的目标物循环和HCR诱导形成DNA水凝胶相结合，构建了一个电化学阻抗生物传感器用于Hg2+的放大检测。在本工作中，将DNAzyme介导的目标循环放大与HCR相结合，在电极表面引入一层DNA水凝胶用作信号放大元件，极大的增强了电化学信号响应，为构建高灵敏电化学传感器提供了可能。该方法充分的利用了水凝胶自身的组成成分及其结构性质，利用DNA水凝胶对信号分子的阻碍作用，显著的增强EIS响应信号，极大的提高了该传感器的灵敏度。此外，利用Hg2+与T碱基特异性识别作用激活Mg2+-DNAzyme以诱发HCR，为该传感器良好的选择性提供了保障。同时，在加标回收实验中也显示出该传感器在实际水样检测中具有较好的准确性。说明该传感器在复杂水样中的应用具有可观的前景，也为开发新的生物传感器以用于环境检测提供了一种新的思路。45 西南大学硕士学位论文第4章基于双重Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略构建免固载微型化电化学检测系统用于Pb2+检测4.1引言铅离子（Pb2+）是土壤和水体中主要的重金属污染物之一，由于其分布广、毒性强受到科研工作者的广泛关注[135-137]。在过去的几年里，Pb2+的分析检测主要依靠于仪器分析（如质谱、光谱和电感耦合等离子体），这些方法虽然具有较高的灵敏度和可靠性，但仍存在繁杂的预处理过程、体积庞大的仪器设备和昂贵的测试费用等不足之处，极大的限制了他们在日常检测中的应用[138,139]。因此，研发一种高灵敏、低成本的检测技术对Pb2+的常规检测具有重要意义[140,141]。电化学方法因其自身低成本、仪器简单和良好的分析性能，在分析检测等领域取得了极大的关注[142,143]。然而，现有的大多数电化学生物传感器仍然具有冗杂的固载过程、繁琐的清洗步骤和不可再生的电极表面等缺陷[143-145]。为了克服这些不足之处，研究人员着眼于研发免固载和可再生的微型化电化学生物传感器，以便于复杂的生物试样和环境试样中的分析检测。随着微型品制造和印刷技术的突破，微型化的电化学生物传感器在定点测试[146-148]、环境保护[149-151]和生物分析[152-155]中受到越来越多的关注。在这些微型化的传感器之中，碳纤维微电极（CFME）由于其成本廉价、生物相容性好、机械强度高和易微型化等特点，在生物医药检测，环境分析监测中越来越受欢迎。与常规的修饰电极相比，CFME具有良好的分析性能和明显的体积优势，但同时也因自身的小尺寸在其制造工艺上具有较大的挑战性。Ohsaka等[156]报道了一种基于CFME的生物传感器用于超氧阴离子检测。在该方法中，CFME的制备需要在100°C下用环氧树脂固化2h，这样苛刻的制备条件难免会造成密封的效果不佳，增加制造难度。在此之后，Chen等[157]提出了一种更为简单的方法，即用火焰熔融法来代替上述的环氧树脂密封法用于构建低噪声的CFME。该方法构建的CFME不仅能够实现有效的密封，同时也能避免环氧树脂带来的污染。然而，在极短的时间内使玻璃管壁融化、密封的过程中，很难保证碳纤维在煤气灯火焰中不会被烧坏，极大的降低了电极的构建产率。最近，Huang等[153]提出了利用石蜡密封玻璃管中的碳化硅纳米线，有效的解决了上述问题。然而，该传感器为保证碳化硅纳米线与外接导线的良好接触，在构建过程中往玻璃管内添加了液态金属，这又增加了造成重金属污染的可能。在上述的背景下，本体系构建了一种简单、高产和环境友好的CFME，完美的解决了上述所罗列的缺点，并成功的用于河水试样中的Pb2+检测。46 第4章基于双重Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略构建免固载微型化电化学检测系统用于Pb2+检测目前，Pb2+特异性的DNAzyme（Pb2+-DNAzyme）因其具有较高催化活性、良好的相容性和可设计性，已逐渐成为构建Pb2+生物传感器的主要策略之一[158,159]。这些独特的优点使其极易与各种DNA放大技术相结合，如聚合酶链式反应（PCR）[160,161]、杂交链式反应（HCR）[162]、滚环扩增反应（RCA）[163,164]。据我们所知，目前主要是GR-5DNAzyme和8-17DNAzyme这两种Pb2+-DNAzyme被广泛的用于构建Pb2+特异性识别的生物传感器。有趣的是，GR-5DNAzyme和8-17DNAzyme能够在相同的条件下识别同一条底物链[165,166]。因此，我们设想能否将这两类Pb2+-DNAzyme整合于同一个放大系统中，以构建一种新颖的放大策略用于高灵敏检测Pb2+。最近，Li等[167]报道了一种基于RCA的反馈放大策略用于miRNA检测。该方法将DNAzyme整合于RCA过程中，构建了一个反馈回路用于目标序列的放大检测。受到该反馈循环设计的启发，本体系试图将GR-5DNAzyme和8-17DNAzyme整合于同一放大系统中的两个RCA的过程中，用于构建一种新颖的反馈放大策略。与一种Pb2+-DNAzyme耦合的RCA系统相比，该策略能够明显的增强检测的灵敏度。在本工作中，将两类Pb2+-DNAzyme整合于同一放大系统的两个RCA的过程中，构建了一种新颖的反馈放大策略，并证明了该策略在用于河水试样中的Pb2+检测具有巨大潜力。利用GR-5DNAzyme和8-17DNAzyme作为目标物的识别元件用于诱发RCA进程，为该放大技术的选择性和灵敏度提供了保证。此外，本体系也提出了一种极其简单并且高效的方法用于构建CFME，即将石蜡作为一种独特的“密封剂”来代替传统的环氧树脂密封法和火焰熔融法，使CFME的构建过程更加的简单、高效、牢固。同时，制备的CFME的尺寸完美的匹配常规的商用微量移液管，为构建一个检测体积低至10μL的微型化电化学检测装置提供了可能。基于上述的双重Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略（DDFA）和CFME组装的微型化电化学装置，该检测系统在微升级的实际样品中对Pb2+检测具有光明的应用前景。4.2实验部分4.2.1试剂铅离子标准溶液（1000µg∙mL-1）由国家有色金属及电子材料分析测试中心（北京，中国）提供。曲拉通X-100、T4DNA连接酶、2,2-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、phi29DNA聚合酶（phi29），T4多聚核苷酸激酶（PNK）、脱氧核苷5′-三磷酸盐混合溶液（dATP,dCTP,dGTP,dTTP）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。亚甲基蓝（MB）购买于科龙化学试剂47 西南大学硕士学位论文厂（成都，中国）。氯高铁血红素（hemin）储存液（5mmol∙L-1）是将hemin溶于二甲基亚砜（DMSO）中制备而成并储存于-20°C阴暗的条件下。实验中所涉及的其它化学试剂均为分析纯，使用前无需进一步纯化。所有的寡核苷酸都是由生工生物工程（上海）股份有限公司（中国，上海）合成并纯化的。如表4.1所示。表4.1.本实验所使用的寡核苷酸序列Table4.1.Sequencesoftheoligonucleotidesusedinthiswork.NameSequence(5′→3′)phosphate-CCCAACCCGCCCTACCCAATCCAACCACACCATCTCTTCC1TCCGAGCCGGTCGAAATAGTGCTCAAACCAGTCTACTACAphosphate-CCCAACCCGCCCTACCCACGAGAGAGATGACGATTAGACC2TATACGGCGGCGCTACTTCAGAGATACAGTCTACTACAMutant-C1phosphate-CCCAACCCGCCCTACCCAATCCAACCACACCATCTCTTC(M-C1)TATCCCACAGTAGCAATAGTGCTCAAACCAGTCTACTACAAGGGCGGGTTGGGTGTAGTAGACTTGTTTAAATGCATATGAGCACL-DNATATrAGGAAGAGATGATCG-InvdTAGGGCGGGTTGGGTGTAGTAGACTTGTTTAAATGCATATGAGCACL-DNA1TATAL-DNA2AGGGCGGGTTGGGTGTAGTAGA4.2.2仪器与测量所有的电化学检测，包括循环伏安法（CV）和交流伏安法（ACV）都是在CHI660E电化学工作站（上海晨华仪器有限公司，中国）上测得的。实验采用的是传统的三电极体系如图4.1A所示，石蜡密封的CFME用作工作电极（WE），将CFME紧紧的插入吸有10μL反应溶液的微量移液管中作为微型化检测装置。铂丝和Ag/AgCl（饱和KCl）电极分别用作对电极（CE）和参比电极（RE）。将100mmol∙L-1磷酸盐缓冲液（PBS）（100mmol∙L-1Na-12HPO4∙12H2O,100mmol∙LKH2PO4,100mmol∙L-1KCl,pH7.4）作为电解液。CV测量是在10mL含有100mmol∙L-1KCl的[Fe(CN)3-/4--16]（5.0mmol∙L）中进行，其电位范围为-0.2V至0.6V。扫描电子显微镜（SEM,FEIQuanta250,USA）和倒置荧光显微镜（OlympusIX-73,OlympusCo.,Ltd.,Tokyo）用于微电极的形貌表征。比色表征图用数码相机（佳能，中国）拍摄。48 第4章基于双重Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略构建免固载微型化电化学检测系统用于Pb2+检测4.2.3碳纤维电极的制备用导电性银漆（电阻<0.02ohm/sq）将直径7μm，长1.5cm的碳纤维连接到一根直径40μm，长5cm铜线上。然后将连接好的碳纤维-铜线插入尖端开口约0.3〜0.4mm的玻璃毛细管中（外径1.0mm，内径0.76mm，长度5cm）中，并调整玻璃毛细管尖端露出的碳纤维长度大约2mm。随后将玻璃毛细管的两端浸入熔化的蜡中，用蜡油密封。最后将裸露出的碳纤维用打火机蚀刻，除去覆盖在碳纤维上的多余蜡，获得一个长度约为2mm、光滑且洁净的碳纤维表面。其原理设计如图4.1B所示。图4.1（A）基于微量移液管的电化学检测系统，（B）CFME的原理设计示意图Fig.4.1(A)Photographofthemicropipettetip-basedelectrochemicalsensingsystem.(B)SchematicofthefabricatedCFME.4.2.4反馈循环放大检测原理将100nmol∙L-1磷酸化的环状DNA模板C1、C2和L-DNA混合于40µLH2O中，并在90°C变性5min，然后再缓慢冷却至室温。然后将5µL10×T4DNA连接酶缓冲液（400mmol∙L-1Tris-HCl,100mmol∙L-1MgCl-12,100mmol∙LDTT,5mmol∙L-1ATP,pH7.8）和1µL5U的T4DNA连接酶加到上述溶液中，并用水定容到50µL。将上述的混合溶液在4°C下孵育过夜，以确保形成DNA复合物L-DNA/Cir1和L-DNA/Cir2。随后将反应混合溶液在65°C中加热10min以终止连接酶反应。反馈循环放大反应是在80µL反应液中进行的，该溶液含有50µL上述制备的连接产物，8µL10×phi29缓冲液（330mmol∙L-1tris-醋酸（37°C下pH值为7.9），100mmol∙L-1乙酸镁，660mmol∙L-1醋酸钾，体积比1%的吐温-20，10mmol∙L-1二硫苏糖醇），1.6µL的phi29（10U∙µL-1），1.6µL的PNK（10U∙µL-1），3.2µL的dNTP混合溶液（25mmol∙L-1）和10µL不同浓度的Pb2+溶液。将该反应液在37°C孵育120min后，在65°C加热10min以终止反馈扩增反应。49 西南大学硕士学位论文4.2.4电化学检测Pb2+在电化学检测实验之前，需先将CFME浸入水中清洗三次。然后将2μLMB溶液（80μmol∙L-1）加入到80μL上述制备的反馈放大反应溶液中，并在37°C下温育18min以形成稳定的G-四联体/MB复合物以用作后面分析溶液。随后将制备好的CFME紧紧地插入到吸取有10μL分析溶液的微量移液管吸头中组成微型化的电化学装置，再放置于电化学电池中以便进一步分析检测。4.2.5凝胶电泳分析分别用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）和10％变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea-PAGE）对体系中的反馈放大的可行性进行分析。在凝胶电泳分析中，将分析试样加入新制备的凝胶切口中，并在1×TBE缓冲液中在120V电压下运行60min，然后用4SGreenDNA染色剂染色40min。最后，用天能-5200多功能化学发光/荧光成像系统对凝胶成像。4.2.6比色表征将含有不同RCA扩增产物和2μmol∙L-1hemin的100µL1×RCA缓冲溶液在室温下孵育40min后，加入2µL的ABTS（最终浓度为20mmol∙L-1）和1µL的H-12O2（最终浓度为8.8mmol∙L），并立即用数码相机拍摄。4.2.7样品制备实际河水试样取自于长江（重庆，中国），将采取的水样用37％的浓HCl以体积比100：1酸化。然后用0.45µm的膜过滤除去粒径较大的不溶性颗粒和藻类。随后将10µL水样中加入T4DNA连接酶的连接产物中以引发反馈扩增过程，其他的反应程序与上述步骤相同。最后用原子吸收分光光度法对河水中Pb2+的实际浓度进行检测以作参照。4.3结果与讨论4.3.1设计及检测原理反馈放大的设计和检测原理如图4.2所示，在该体系中巧妙的设计了两个环状DNA模板C1、C2和线性DNA（L-DNA）：（I）C1由8-17DNAzyme序列和G-四联体的反义序列（anti-G-四联体）组成；（II）C2由GR-5DNAzyme的反义序列（anti-GR-5DNAzyme）和anti-G-四联体序列组成；（III）L-DNA由三部分组成：一段用于与C1或C2杂交的线性寡核苷酸序列，一段含有RNA修饰的序列用作Pb2+-DNAzyme剪切底物，以及一段3'端标记有反向dT（invdT）的序列用于50 第4章基于双重Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略构建免固载微型化电化学检测系统用于Pb2+检测抑制phi29的扩展活性[168]。在T4DNA连接酶的帮助下，C1和C2均可与L-DNA形成两个DNA杂交复合物L-DNA/Cir1和L-DNA/Cir2。在没有Pb2+的情况下，8-17DNAzyme不具有生物催化活性，无法对底物L-DNA进行剪切，因此大部分MB分子以游离态形式存在于溶液中，在CFME表面产生较强的扩散电流。相反，在Pb2+存在溶液中时，8-17DNAzyme的剪切活性被激活，将在L-DNA上标记有RNA的剪切位点进行特异性剪切。在8-17DNAzyme剪切后，L-DNA剩下的与Cir2杂交的片段将用作RCA的引物序列。将引物末端用PNK处理除去2,3-环状磷酸酯后[169,170]，在phi29和dNTPs存在下，C2介导的RCA过程将会产生具有大量重复的G-四联体序列和GR-5DNAzyme单元的DNA长链。生成的GR-5DNAzyme序列又能与L-DNA/Cir1复合物中的L-DNA杂交，引发C1介导的RCA过程，产生更多的具有重复G-四联体序列的DNA长链。因此，经过双重RCA介导反馈放大过程之后，溶液中将会有大量的G-四联体序列生成。由于MB能够嵌入G-四链体中形成的稳定的MB/G-四联体复合物，溶液中的自由MB分子将会被G-四链体捕获，降低在向CFME表面的扩散速率，从而产生较弱的扩散电流[171,172]。通过上述方法制备的微型化电化学传感系统，能够实现溶液中Pb2+的高灵敏、准确的检测。图4.2基于双Pb2+-DNAzyme反馈扩增策略和微型化电化学装置用于Pb2+检测的原理Fig.4.2PrincipleandproceduresofthedualPb2+-DNAzymefeedbackamplificationstrategyforPb2+sensingbasedonamicropipettetip-basedminiaturizedelectrochemicaldevice.51 西南大学硕士学位论文4.3.2CFME的形貌表征在SEM表征过程中，为了促进显微可视化，我们在碳纤维的表面喷了一层金，其持续时间为90s。如图4.3A所示，从碳纤维和石蜡界面的SEM图中可以清楚地看到碳纤维被很好地密封在的玻璃毛细管内，其纤维的直径约为7.303µm（图4.3B）。为了更加直观、深入的了解石蜡的密封效果，本体系还采用荧光显微镜对CFME进行了表征。如图4.3C所示，碳纤维被紧密的密封于玻璃毛细管的尖端，其突出的长度约为2mm。此外，在图4.4D中展示了铜丝和碳纤维结合处的显微镜放大图像，可以看出碳纤维与铜线接触良好，为CFME良好的电子传递做出了保障。图4.3SEM成像分析(A)碳纤维和石蜡的密封界面的SEM图；(B)碳纤维的SEM图；(C)碳纤维和蜡的密封界面的显微镜成像；(D)铜线和碳纤维的连接处的显微镜图。Fig4.3SEMimagesof(A)theinterfaceofcarbonfiberandwax,(B)thecarbonfiber.SamplespreparedbycoatingasputteredAulayerwithatimeinterval90s.Microscopeimagesof(C)theinterfaceofcarbonfiberandwax,(D)thejointofcopperwireandcarbonfiber.4.3.2基于CFME的微型化电化学装置的可行性及性能分析由于Fe(CN)3-/4-6在电极表面的电子转移能力能够直接反映电极表面的性质，因此将CFME插入10μL微量移液管中与CFME直接放入含有10mL5mmol∙L-1Fe(CN)3-/4-6的电化学电池中的CV曲线进行了比较，用以探究微型化电化学装置52 第4章基于双重Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略构建免固载微型化电化学检测系统用于Pb2+检测的可行性。如图4.4所示，在扫描速率为100mV/s下，基于CFME的微型化电化学装置的CV曲线（曲线a）是典型准稳态电流曲线，与大体积的电化学电池中的CV曲线（曲线b）几乎相同。该结果与先前报道的方法构建的CFME一致[173]，说明使用基于石蜡密封的CFME用于构建微型化电化学装置的方法是可行的、成功的。同时，本体系还对CFME在5mmol∙L-1Fe(CN)3-/4-6中不同的扫描速率下的CV线进行了探究，以分析CFME的电化学性能。如图4.5A所示，在扫描速率为20mV/s至300mV/s时，阴极和阳极的CV曲线随着扫速的增加而增加。其电流峰值与扫描速率的平方根成线性相关系（图4.5B），表明电极表面的电子转移是扩散过程控制的。图4.4基于CFME的微型化电化学装置的可行性研究Fig.4.4CVsresponsesoftheCFME(a)insertedintoamicropipettetipwith10μL5mmol∙L-1Fe(CN)63-/4-,and(b)directlyplacedintoaelectrochemicalcellcontaining10mL5mmol∙L-1Fe(CN)63-/4-.Thescanratewas100mV/s.图4.5（A）微型化电化学装置在不同的扫描速率下CV响应曲线；（B）不同扫速下CV曲线的阳极和阴极电流峰值与扫描速率的平方根之间的线性关系。Fig.4.5(A)CVresponsesoftheelectrochemicaldevicein5mmol∙L-1Fe(CN)63-/4-withvaryingscanratesfrom20to300mV/s.(B)Thelinearrelationsoftheelectrochemicaldevicewiththeanodicandcathodicpeakcurrentagainstthesquarerootofscanrate.53 西南大学硕士学位论文此外，本体系还对CFME在5mmol∙L-1Fe(CN)3-/4-6中的连续稳态循环伏安曲线进行了研究，以评价微型化电化学装置的稳定性。如图4.6A所示，在100mV/s的扫描速率下连续扫描100个循环后，发现仅有1.38％和5.14％的氧化和还原电流信号降低，表明在1min的检测时间内，样品溶液从微量移液管泄漏到电化学电池中的量几乎是可以忽略不计的。换言之，基于石蜡密封的微电极构建的电化学装置即使在样品溶液降至10μL时也能保持良好的稳定性。同时，还分别研究了CFME在10μL的样品溶液（含1nmol∙L-1的Pb2+）和PBS溶液（无Pb2+）中的10次重复检测ACV曲线，来评估CFME的可重用性能力。如图4.6B所示，当使用CFME测量样品溶液时，可以观察到明显的电化学响应信号（定义为n'，n=1,2，...），而当使用CFME测量0.1mol∙L-1PBS溶液时，几乎没有电化学响应（定义为n，n=1,2...）。上述结果表明，石蜡密封的CFME在重复用于Pb2+的检测过程中未受到任何污染，能够多次重复使用。综上结果表明，基于石蜡密封的CFME和微型化电化学装置的制备是成功的。图4.6（A）微型化电化学装置的稳定性；（B）微型化电化学装置可重用性。Fig.4.6(A)Stabilityofthemicropipettetip-basedelectrochemicaldeviceundersuccessiveCVscans(100cycles)in5mmol∙L-1Fe(CN)63-/4-atscanrateof100mV/s.(B)TheACVresponsesoftheCFMEinsamplesolutions(containing1nmol∙L-1ofPb2+)andPBSsolutionsfor10timesrepeatmeasurement.4.3.3Pb2+-DNAzyme的催化剪切活性在本体系中，双Pb2+-DNAzyme的催化剪切活性是成功实施DDFA的先决条件，因此用10％的Urea-PAGE来探究剪切模式I中8-17DNAzyme的剪切活性。如图4.7B所示，我们可以清楚地观察到泳道1和2中的C1和L-DNA1条带。由于在C1和L-DNA1的连接酶的产物中加了入phi29，L-DNA1的3'-末端未配对的核苷酸被phi29修剪，因此在泳道3中L-DNA1的条带消失，同时出现了分54 第4章基于双重Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略构建免固载微型化电化学检测系统用于Pb2+检测子量较高的Cir1条带。此外，L-DNA2在第3泳道中并没有出现，这可能是L-DNA2的分子量较低和聚丙烯酰胺的百分比含量较低的缘故。该结果表明，L-DNA2/Cir1杂交复合物的制备是成功的。用T4连接酶孵育C2和L-DNA的混合物后，泳道6出现了分子量相对较高的Cir2条带和两条分别与泳道4中的C2和泳道5中L-DNA匹配的弱带，表明了L-DNA/Cir2的制备是成功的。最后在Pb2+存在的条件下，将L-DNA2/Cir1和L-DNA/Cir2的混合物在37°C下孵育120min，泳道7中出现了一条分子质量相对较低的条带，该条带与泳道2中的L-DNA1的条带匹配，说明L-DNA/Cir1中的8-17DNAzyme对L-DNA/Cir2中的L-DNA具有剪切活性。图4.7（A）剪切模式I示意图；（B）剪切模式I中8-17DNAzyme的剪切活性的Urea-PAGE分析。Fig.4.7(A)SchemeofthecleavagemodeI.(B)Urea-PAGEanalysisofthecleavageactivityof8-17DNAzymeincleavagemodeI.Lane1,C1(79nt);lane2,L-DNA1(49nt);lane3,ligaseproductofL-DNA1andC1incubatedwithphi29(0.4U);lane4,C2(77nt);lane5,L-DNA(63nt);lane6,ligaseproductofC2andL-DNA;lane7,themixtureofL-DNA2/Cir1andL-DNA/Cir2inthepresenceofPb2+.此外，还利用10%的Urea-PAGE对剪切模式II中C2介导的RCA产物对L-DNA/Cir1的剪切活性进行了探究。为了避免8-17DNAzyme的剪切作用，本体系重新设计了一条突变的C1单链寡核苷酸（M-C1），用以替换环状DNA模板C1。M-C1除了8-17DNAzyme环状部分与C1不同以外其余序列均与C1一致（其序列见表4.1）。如图4.8B所示，在泳道1-3中分别出现了与L-DNA，L-DNA1和M-C1对应的三条明亮条带。在L-DNA和M-C1的混合物经T4连接酶连接以后，泳道4中出现分子量较高条带，同时还出现了明亮的L-DNA和M-C1的暗55 西南大学硕士学位论文条带，说明成功的制备了L-DNA/M-Cir1。在RCA扩增后，在泳道5中可观察到高分子量的RCA产物条带和Cir2条带。由于L-DNA1在RCA过程中会被消耗并且会被phi29水解成更小的L-DNA2片段，因此L-DNA2不易出现在百分比较低的聚丙烯酰胺凝胶中。当C2介导的RCA产物与L-DNA/M-Cir1混合时，在Pb2+存在下，泳道6中可以观察到较低分子量的条带，该条带与泳道2中的L-DNA1条带匹配，说明了Cir2介导的RCA产物对L-DNA/Cir1中的L-DNA具有剪切活性。图4.8（A）剪切模式II示意图；（B）剪切模式II中C2介导的RCA产物的剪切活性的Urea-PAGE分析。Fig.4.8(A)SchemeofthecleavagemodeII.(B)Urea-PAGEcharacterizeofthecleavageactivityofC2-mediatedRCAproductionincleavagemodeII.Lane1,L-DNA;lane2,L-DNA1;lane3,M-C1;lane4,theligaseproductofL-DNAandM-C1;lane5,L-DNA1/Cir2mediatedRCAproduct;lane6,themixtureofC2-mediatedRCAproductandtheligaseproductofL-DNAandM-C1.Allthefinalconcentrationofthesampleswas4μmol∙L-1.4.3.4反馈放大可行性探究为研究改体系的可行性，将10%的非变性PAGE对反应过程中DNA的构型和DDFA进行了分析。如图4.9A所示，泳道1是DNAmarker，泳道2-4分别是C1，C2和L-DNA条带。将C1和L-DNA的混合物以及C2和L-DNA的混合物分别用T4连接酶处理后，在泳道5和6中分别出现两条分子量较高的条带，表明L-DNA/Cir1和L-DNA/Cir2已成功制备。当反馈放大系统中孵育有Pb2+时，泳道8中呈现出分子量更高的条带。相反，当系统没有Pb2+时，泳道9的条带与泳道7中C1，C2和L-DNA的连接产物的条带相匹配。以上结果表明，该检测系统中的DNA序列设计是合理的。56 第4章基于双重Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略构建免固载微型化电化学检测系统用于Pb2+检测图4.9（A）反馈放大系统的非变性PAGE表征；（B）空白样品的ACV响应曲线（a），检测系统在没有孵育C2（b）和孵育有C2（c）的ACV响应曲线。插图：ACV曲线对应的样本溶液的颜色变化图片。Fig.4.9PolyacrylamidegelcharacterizationofthefeedbacksystemforPb2+sensing.Lane1,DNAmarker;lane2,C1;lane3,C2;lane4,L-DNA;lane5,theligaseproductofC1andL-DNA;lane6,theligaseproductofC2andL-DNA;lane7,theligaseproductofC1,C2andL-DNA;thereactionofthefeedbackamplificationsensingsystemincubatedwith(lane8)without(lane9)Pb2+.Allthefinalconcentrationofthesamplesis4μmol∙L-1.(B)ACVresponsesofblanksample(a),thesensingsystemwereincubatedwithout(b)andwith(c)C2.Inset:thephotographshowsthecorrespondingcolorchangeofthesamplesolution.4.3.5DDFA对信号放大的效果在本体系中，DDFA作为一种信号放大策略，其对信号放大效果是主要关注点之一。为了探究和验证该策略的放大效果，对比了在检测系统中，有无C2介导的RCA的情况下的ACV响应曲线进行了研究。如图4.9B所示，当检测系统中仅有C1介导的RCA时（b），与空白响应信号（a）相比电化学信号有所减弱（ΔI=21nA）。而在检测系统由双重Pb2+-DNAzyme介导的RCA时（c），MB的扩散电流显著降低（ΔI=39nA）。上述结果表明，基于双重Pb2+-DNAzyme的RCA介导的反馈放大能够使电化学信号显著改变。此外，我们进一步的采用比色表征来验证上述结论。由于hemin能够与G-四联体结合形成hemin/G-四联体，在H2O2存在条件下，可以催化氧化发色底物ABTS引起颜色改变。在没有Pb2+时，由于检测系统中没有形成hemin/G-四联体，溶液的颜色几乎不发生改变（a）。相反，在Pb2+存在于系统中时，可以清楚地观察到溶液的颜色由无色变为深绿色（c），该颜色比仅由C1介导的RCA颜色更深（b）。结果表明，双重Pb2+-DNAzyme介57 西南大学硕士学位论文导的RCA反馈放大过程能够诱导更多的G-四链体序列产生，提高体系中的过氧化物模拟酶的含量。4.3.5实验条件优化为了实现上述检测系统对Pb2+的高灵敏检测，我们对实验中的检测条件（如MB的浓度和孵育时间，phi29的浓度及RCA反应时间）进行了优化。由于该检测系统是基于MB扩散电流峰值的变化而测定的，因此适量的MB是定量检测的关键。为了达到最佳的信噪比，须对MB的浓度进行优化。如图4.10A中所示，MB浓度在0.5μmol∙L-1到2μmol∙L-1范围内的峰电流缓慢增加，说明MB分子嵌入G-四联体结构中并未达到饱和点。当MB的浓度超过2μmol∙L-1时，峰电流值突然增加。该现象说明溶液中MB的浓度过饱和，并且过量的MB在溶液中是以游离状态存在，导致扩散电流迅速增加，因此在后续的实验中将2μmol∙L-1作为MB的最佳浓度。图4.10（A）MB浓度对电化学信号的影响；（B）MB反应时间对电化学信号的影响；（C）phi29浓度对电化学信号的影响；（D）phi29反应时间对电化学信号的影响。Fig.4.10ACVresponseof(A)differentMBconcentration;(B)differentintercalatedtimeofMB;(C)differentconcentrationofphi;(D)differentRCAreactiontime.已有的报道中表明MB是通过π-π堆积作用嵌入G-四联体中的，该过程需要一定的时间来完成。因此，为了得到稳定的G-四联体/MB复合物，须对MB的孵58 第4章基于双重Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略构建免固载微型化电化学检测系统用于Pb2+检测育时间进行优化。如图4.10B所示，随着孵育时间的增加峰电流持续降低直到孵育时间达到18min，而进一步的延长孵育时间不会产生明显效果，故将18min作为MB的最佳孵育时间。此外，由于反馈放大策略主要依赖于phi29高的持续合成能力和3'→5'的校对活性，phi29的浓度是实现DDFA的另一关键因素，因此需对phi29的浓度进行优化。从图4.10C可以看出，随着phi29浓度从0U/μL增加到0.15U/μL，峰电流值明显降低。当phi29浓度增加到0.2U/μL时，峰值电流仅略有下降，故将0.2U/μL作为phi29的最佳浓度。反馈扩增的反应时间与电流信号的关系如图4.10D所示，随着反应时间的延长，峰电流迅速降低。当反应时间超过120min后，电化学信号没有明显变化，因此将120min作为最佳的扩增时间。4.3.6Pb2+的定量检测在最优的实验条件下，将上述检测系统用于一系列的Pb2+浓度检测以评估该检测系统的分析性能。如图4.11A所示，随着Pb2+浓度从0增加到100nmol∙L-1，MB的扩散电流持续降低，表明高浓度的Pb2+能够诱导更多的G-四联体生成，产生较低的扩散电流。图4.11B展示了ACV峰电流值与Pb2+浓度的对数在0.2pmol∙L-1至100nmol∙L-1范围内的良好线性相关性。其线性相关方程为I=-9.95lgc（nmol∙L-1）+298.97，相关系数为r=0.9985，检测限为0.048pmol∙L-1。该检测限值明显低于美国环境保护局（EPA）对饮用水中Pb2+的检出量（72.4nmol∙L-1）。此外，我们也将上述方法构建的传感器与已报道的Pb2+电化学检测方法进行了比较。从表4.2可以得出，上述方法制备的电化学检测系统具有较高的灵敏度。图4.11（A）电化学检测系统对不同浓度Pb2+的ACV响应曲线和（B）ACV峰电流与Pb2+浓度的对数的标准曲线Fig.4.11(A)ACVresponsesofthesensingsystemafterincubatingwithdifferentconcentrationsofPb2+:(a)0fmol∙L-1,(b)0.2pmol∙L-1,(c)0.5pmol∙L-1,(d)1pmol∙L-1,(e)5pmol∙L-1,(f)10pmol∙L-1,(g)50pmol∙L-1,(h)100pmol∙L-1,(i)500pmol∙L-1,(j)1nmol∙L-1,(k)10nmol∙L-1(l)100nmol∙L-1.(B)ACVpeakcurrentplotsversusthelogarithmconcentrationofPb2+.59 西南大学硕士学位论文表4.2本实验构建的电化学检测系统与已报道的Pb2+检测方法性能比较Table4.2ComparisonwiththosepreviouslyreportedPb2+detectionmethods.DetectionmethodsLinearrangeDetectionlimitReferenceChronoamperometric0.05nmol∙L-1-200nmol∙L-134pmol∙L-1174Electrochemiluminescence0.3pmol∙L-1-1umol∙L-110pmol∙L-1175Electrochemiluminescence100nmol∙L-1-10umol∙L-170nmol∙L-1176Amperometric5pmol∙L-1-1umol∙L-12pmol∙L-1177Anodicstrippingvoltammetry2.4nmol∙L-1-0.48umol∙L-10.97nmol∙L-1178Differentialpulsevoltammetry0.03nmol∙L-1-1umol∙L-10.02nmol∙L-1179ACvoltammetry0.2pmol∙L-1-100nmol∙L-10.048pmol∙L-1Ourwork4.3.7检测系统的选择性和重现性研究将环境中与Pb2+共存的一系列金属离子（如Fe3+,Mn2+,Ag+,Ba2+,Cu2+,Al3+,Ca2+,Ni2+,Cd2+,Co2+,Cr3+）分别添加到分析试样中，以评价该检测系统的选择性。如图4.12A所示，当检测体系中孵育有0.5nmol∙L-1的Pb2+时，可观察到峰电流的显著降低，然而干扰金属离子即使在较高的浓度（50nmol∙L-1）下，也不会引起峰电流的明显变化。这一结果表明上述制备的检测系统对Pb2+的检测具有良好的选择性。此外，还对同一批次中的五个不同CFME电化学装置的ACV响应信号进行了研究，其结果如图4.12B所示，其相对标准偏差（RSD）为1.22％，表明上述制备的电化学检测装置具有较好的选择性和重现性。图4.12（A）电化学检测系统的选择性；（B）电化学检测系统的重现性。Fig.4.12(A)Theselectivityofthesensingsystemfor0.5nmol∙L-1Pb2+againstvariouskindsofinterferenceions(Fe3+,Mn2+,Ag+,Ba2+,Cu2+,Al3+,Ca2+,Ni2+,Cd2+,Co2+,Cr3+each50nmol∙L-1).(B)Reproducibilityofthesensingsystemwithincubating0.5nmol∙L-1Pb2+.60 第4章基于双重Pb2+-DNAzyme辅助的反馈放大策略构建免固载微型化电化学检测系统用于Pb2+检测4.3.8实际样品检测为了探究该检测系统在实际样品中的分析可靠性，将其用于长江（重庆，中国）水样中的游离Pb2+检测。其分析结果如表4.3所示，可以清楚地看到其回收率为94.7％至106.7％，RSD为2.8%至3.7%，同时该结果与AAS分析数据相吻合，表明上述检测系统对实际环境水样中的Pb2+检测具有潜在的应用价值。表4.3上述检测系统和原子吸收光谱法对长江水样中Pb2+的检测。Table4.3.DeterminationofPb2+inriversamplesbytheproposedsensingsystemandAAS.FoundRecoveryRSD(%)AASFoundRelativeerrorSamples(nmol∙L-1)(%)(n=3)(nmol∙L-1)(%)1(107°4′1″E,29°49′19″N)16.5106.73.715.47.12(107°22′39″E,29°43′6″N)17.296.12.817.9-3.93(107°43′40″E,29°52′29″N)25.4103.23.124.63.34(108°43′36″E,30°55′27″N)16.094.73.416.9-5.35(109°52′46″E,31°4′30″N)12.797.73.513.0-2.34.4结论本实验基于双重Pb2+-DNAzyme介导的反馈放大策略和免固载的均相微型化电化学装置构建了一个高灵敏的电化学检测系统用于Pb2+检测。采用双重Pb2+-DNAzyme作为识别元件用以介导两个RCA过程，确保了该检测系统的高选择性。同时，Pb2+能够诱导两条路径RCA过程形成反馈扩增回路，即使少量目标Pb2+也可诱导产生大量G-四联体序列，引起电化学响应信号的明显降低，从而可实现对Pb2+的高灵敏检测。本体系还提出了一种简单、高效的方法用于构建CFME。将石蜡作为一种新颖的“密封剂”用于密封碳纤维和玻璃毛细管，可实现碳纤维稳定的固载和有效的密封，同时可实现对碳纤维长度的可控。此外，使用石蜡密封的CFME构建微型化电化学装置不仅具有良好的分析性能，同时还能将样品溶液的体积减少至几微升，实现了在Pb2+微升级的检测。最后，上述检测系统能够成功的应用于河水水样检测，展现出良好的检测结果，为Pb2+的常规检测提供了一种新的思路。61 西南大学硕士学位论文参考文献[1]IqbalS.S.,MayoM.W.,BrunoJ.G.,et.al,Areviewofmolecularrecognitiontechnologiesfordetectionofbiologicalthreatagents.Biosens.Bioelectron.,2000,15,549-578.[2]LiuJ.,CaoZ.,LuY.,Functionalnucleicacidsensors.Chem.Rev.,2009,109,1948-1998.[3]ClarkL.C.,LyonsC.,Electrodesystemsforcontinuousmonitoringincardiovascularsurgey.Ann.N.Y.Acad.Sci.,1962,102,29-45.[4]LoweC.R.,Biosensors.TrendsBiotechnol.,1984,2,59-65.[5]PrathapM.U.A.,RodriguezC.I.,SadakO.,GuanJ.H.,SetaluriV.,GunasekaranS.,Ultrasensitiveelectrochemicalimmunoassayformelanomacellsusingmesoporouspolyaniline.Chem.Commun.,2018,54,710-714.[6]YangJ.M.,DouB.T.,YuanR.,XiangY.,Proximitybindingandmetalion-dependentDNAzymecyclicamplification-integratedaptasensorforlabel-freeandsensitiveelectrochemicaldetectionofthrombin.Anal.Chem.,2016,88,8218-8223.[7]WangM.H.,ZhaiS.Y.,YeZ.H.,HeL.H.,PengD.L.,FengX.Z.Yang,Y.Q.,FangS.M.,ZhangH.Z.,ZhangZ.H..AnelectrochemicalaptasensorbasedonaTiO2/three-dimensionalreducedgrapheneoxide/PPynanocompositeforthesensitivedetectionoflysozyme.DaltonTrans.,2015,44,6473-6479.[8]FrewJ.E.,HillH.,Electrochemicalbiosensors.Anal.Chem.,1987,59,933-944.[9]Updike,S.J.,HicksG.P.,Theenzymeelectrode.Nature,1967,214,986-988.[10]LiJ.,LiuY.L.,ZhuX.Q.,ChangG.,HeH.P.,ZhangX.H.,WangS.F.,Anovelelectrochemicalbiosensorbasedonadouble-signaltechniqueford(CAG)ntrinucleotiderepeats.ACSAppl.Mater.Interfaces,2017,9,44231-44240.[11]XuL.,LiangW.,WenY.L.,WangL.L.,YangX.,RenS.Z.,JiaN.Q.,ZuoX.L.,LiuG.,AnultrasensitiveelectrochemicalbiosensorforthedetectionofmecAgeneinmethicillin-resistantstaphylococcusaureus.Biosens.Bioelectron.,2018,99,424-430.[12]CaiX.H.,WengS.H.,GuoR.B.,LinL.Q.,ChenW.,ZhengZ.F.,HuangZ.J.,LinX.H.,Ratiometricelectrochemicalimmunoassaybasedoninternalreferencevalueforreproducibleandsensitivedetectionoftumormarker.Biosens.Bioelectron.,2016,81,173-180.[13]KangC.,KangJ.,LeeN.S.,YoonY.H.,H.Yang,DT-diaphoraseasabifunctionalenzymelabelthatallowsrapidenzymaticamplificationandelectrochemicalredoxcycling.Anal.Chem.,2017,89,7974-7980.62 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西南大学硕士学位论文[115]ShimronS.,ElbazJ.,HenningA.,WillnerI.,Ion-inducedDNAzymeswitches.Chem.Commun.,2010,46,3250-3252.[116]LiX.,XieJ.Q.,JiangB.Y.,YuanR.,XiangY.,BiodegradableMnO2nanosheet-mediatedsignalamplificationinlivingcellsenablessensitivedetectionofdown-regulatedintracellularmicroRNA.ACSAppl.Mater.Interfaces,2017,9,5733-5738.[117]HuY.W.,GuoW.W.,KahnJ.S.,Aleman-GarciaM.A.,WillnerI.,Ashape-memoryDNA-basedhydrogelexhibitingtwointernalmemories.Angew.Chem.Int.Ed.,2016,55,4210-4214.[118]GuoW.W.,QiX.J.,OrbachR.,LuC.H.,FreageL.,Mironi-HarpazI.,SeliktarD.,YangH.H.,WillnerI.,ReversibleAg+-crosslinkedDNAhydrogels.Chem.Commun.,2014,50,4065-4068.[119]ZinchenkoA.,MiwaY.,LopatinaL.I.,SergeyevV.G.,MurataS.,DNAhydrogelasatemplateforsynthesisofultrasmallgoldnanoparticlesforcatalyticapplications.ACSAppl.Mater.Interfaces,2014,6,3226-3232.[120]GuoW.W.,LuC.H.,OrbachR.,WangF.,QiX.J.,CecconelloA.,SeliktarD.,WillnerI.,pH-stimulatedDNAhydrogelsexhibitingshape-memoryproperties.Adv.Mater.,2015,27,73-78.[121]LilienthalS.,ShpiltZ.,WangF.,OrbachR.,WillnerI.,ProgrammedDNAzyme-triggereddissolutionofDNA-basedhydrogels:meansforcontrolledreleaseofbiocatalystsandfortheactivationofenzymecascades.ACSAppl.Mater.Interfaces,2015,7,8923-8931.[122]SoontornworajitB.,ZhouJ.,ZhangZ.,WangY.,Aptamer-functionalizedinsituinjectablehydrogelforcontrolledproteinrelease.Biomacromolecules,2010,11,2724-2730.[123]BiS.,XiuB.,YeJ.Y.,DongY.,Target-catalyzedDNAfour-wayjunctionsforCRETimagingofmicroRNA,concatenatedlogicoperations,andself-assemblyofDNAnanohydrogelsfortargeteddrugdelivery.ACSAppl.Mater.Interfaces,2015,7,23310-23319.[124]HuangY.S.,MaY.L.,ChenY.H.,WuX.M.,FangL.T.,ZhuZ.,YangC.Y.,Target-responsiveDNAzymecross-linkedhydrogelforvisualquantitativedetectionoflead.Anal.Chem.,2014,86,11434-11439.[125]LiuR.D.,HuangY.S.,MaY.L.,JiaS.S.,GaoM.X.,LiJ.X.,ZhangH.M.,XuD.M.,WuM.,ChenY.,ZhuZ.,YangC.Y.,Designandsynthesisoftarget-responsiveaptamer-cross-linkedhydrogelforvisualquantitativedetectionofOchratoxinA.ACSAppl.Mater.Interfaces,2015,7,6982-6990.72 参考文献[126]GibbsJ.M.,ParkS.J.,AndersonD.R.,WatsonK.J.,MirkinC.A.,NguyenS.T.,Polymer-DNAhybridsaselectrochemicalprobesforthedetectionofDNA.J.Am.Chem.Soc.,2005,127,1170-1178.[127]KahnJ.S.,TrifonovA.,CecconelloA.,GuoW.W.,FanC.H.,WillnerI.,IntegrationofswitchableDNA-basedhydrogelswithsurfacesbythehybridizationchainreaction.NanoLett.,2015,15,7773-7778.[128]YangZ.H.,ZhuoY.,YuanR.,ChaiY.Q.,Amplifiedimpedimetricaptasensorcombiningtarget-inducedDNAhydrogelformationwithpH-stimulatedsignalamplificationfortheheparanaseassay.Nanoscale,2017,9,2556-2562.[129]HouL.,GaoZ.Q.,XuM.D.,CaoX.,WuX.P.,ChenG.N,TangD.P.,DNAzyme-functionalizedgold-palladiumhybridnanostructuresfortriplesignalamplificationofimpedimetricimmunosensor.Biosens.Bioelectron.,2014,54,365-371.[130]Fernandez-SanchezC.,McNeilC.J.,RawsonK.,Electrochemicalimpedancespectroscopystudiesofpolymerdegradation:applicationtobiosensordevelopment.TrendsAnal.Chem.,2005,24,37-48.[131]YangL.,ZhangC.H.,JiangH.,LiG.J.,WangJ.H.,WangE.K.,Insertionapproach:bolsteringthereproducibilityofelectrochemicalsignalamplificationviaDNAsuperstructures.Anal.Chem.,2014,86,4657-4662.[132]YuanY.L.,GaoM.,LiuG.P.,ChaiY.Q.,WeiS.Q.,YuanR.,SensitivepseudobienzymeelectrocatalyticDNAbiosensorformercury(II)ionbyusingtheautonomouslyassembledhemin/G-quadruplexDNAzymenanowiresforsignalamplification.Anal.Chim.Acta,2014,811,23-28.[133]BaoT.,WenW.,ZhangX.H.,XiaQ.H.,WangS.F.,Anexonuclease-assistedamplificationelectrochemicalaptasensorforHg2+detectionbasedonhybridizationchainreaction.Biosens.Bioelectron.,2015,70,318-323.[134]QiuZ.L.,TangD.Y.,ShuJ.,ChenG.N.,TangD.P.,Enzyme-triggeredformationofenzyme-tyramineconcatamersonnanogold-functionalizeddendrimerforimpedimetricdetectionofHg(II)withsensitivityenhancement.Biosens.Bioelectron.,2016,75,108-115.[135]OrtaJ.,PattonS.,LiuH.Z.,Bromide-assistedcatalyticoxidationoflead(II)solidsbychlorineindrinkingwaterdistributionsystems.Chem.Commun.,2017,53,8695-8698.[136]CaiF.X.,WangQ.H.,ChenX.Q.,QiuW.W.,Zhan,F.P.,GaoF.,WangQ.X.,SelectivebindingofPb2+withmanganese-terephthalicacidMOF/SWCNTs:Theoreticalmodeling,experimentalstudyandelectroanalyticalapplication.Biosens.Bioelectron.,2017,98,310-316.73 西南大学硕士学位论文[137]RuddN.D.,WangH.,Fuentes-FernandezE.M.A.,TeatS.J.,ChenF.,HallG.,ChabalY.J.,LiJ.,Highlyefficientluminescentmetal-organicframeworkforthesimultaneousdetectionandremovalofheavymetalsfromwater.ACSAppl.Mater.Interfaces,2016,8,30294-30303.[138]ZhouQ.,LinY.X.,LinY.P.,WeiQ.H.,ChenG.N.,TangD.P.,HighlysensitiveelectrochemicalsensingplatformforleadionbasedonsynergeticcatalysisofDNAzymeandAu-Pdporousbimetallicnanostructures.Biosens.Bioelectron.,2016,78,236-243.[139]ZhouG.H.,ChangJ.B.,CuiS.M.,PuH.H.,WenZ.H.,ChenJ.H.,Real-time,selectivedetectionofPb2+inwaterusingareducedgrapheneoxide/goldnanoparticlefield-effecttransistordevice.ACSAppl.Mater.Interfaces,2014,6,19235-19241.[140]LiangW.B.,ZhuoY.,ZhengY.N.,XiongC.Y.,ChaiY.Q.,YuanR.,ElectrochemiluminescentPb2+-drivencircularetchingsensorcoupledtoaDNAmicronet-carrier.ACSAppl.Mater.Interfaces,2017,9,39812-39820.[141]ZangY.,LeiJ.P.,HaoQ.,JuH.X.,“Signal-on”photoelectrochemicalsensingstrategybasedontarget-dependentaptamerconformationalconversionforselectivedetectionoflead(II)ion.ACSAppl.Mater.Interfaces,2014,6,15991-15997.[142]KongR.M.,ZhangX.B.,ZhangL.L.,JinX.Y.,HuanS.Y.,ShenG.L.,YuR.Q.,Anultrasensitiveelectrochemical“turn-on”label-freebiosensorforHg2+withAuNP-functionalizedreporterDNAasasignalamplifier.Chem.Commun.,2009,37,5633-5635.[143]ShinS.R.,KilicT.,Zhang,Y.S.,AvciH.,HuN.,KimD.,BrancoC.,AlemanJ.,MassaS.,SilvestriA.,KangJ.,DesalvoA.,HussainiM.A.,ChaeS.K.,Polini,A.,BhiseN.,HussainM.A.,LeeH.,DokmeciM.R.,KhademhosseiniA.,Label-freeandregenerativeelectrochemicalmicrofluidicbiosensorsforcontinualmonitoringofcellsecretomes.Adv.Sci.,2017,5,1600522.[144]HouT.,LiW.,LiuX.J.,LiF.,Label-Freeandenzyme-freehomogeneouselectrochemicalbiosensingstrategybasedonhybridizationchainreaction:afacile,sensitive,andhighlyspecificmicroRNAassay.Anal.Chem.,2015,87,11368-11374.[145]TanY.,QiuJ.Z.,CuiM.Y.,WeiX.F.,ZhaoM.M.,QiuB.,ChenG.N.,AnimmobilizationfreeDNAzymebasedelectrochemicalbiosensorforleaddetermination.Analyst,2016,141,1121-1126.[146]SempionattoJ.R.,MishraR.K.,MartinA.,TangG.D.,NakagawaT.,LuX.L.,CampbellA.S.,LyuK.M.,WangJ.,Wearablering-basedsensingplatformfordetectingchemicalthreats.ACSSens.,2017,2,1531-1538.74 参考文献[147]HrdyR.,KynclovaH.,KlepacovaI.,BartosikM.,NeuzilP.,Portablelock-inamplifier-basedelectrochemicalmethodtomeasureanarrayof64sensorsforpoint-of-careapplications.Anal.Chem.,2017,89,8731-8737.[148]HsiehK.,PattersonA.S.,FergusonB.S.,PlaxcoK.W.,SohH.T.,Rapid,sensitive,andquantitativedetectionofpathogenicDNAatthepointofcarethroughmicrofluidicelectrochemicalquantitativeloop-mediatedisothermalamplification.Angew.Chem.Int.Ed.,2012,51,4896-4900.[149]HuangY.Z.,LiL.,ZhangY.,ZhangL.N.,GeS.G.,LiH.,YuJ.H.,Ceriumdioxide-mediatedsignal“on-off”byresonanceenergytransferonalab-on-paperdeviceforultrasensitivedetectionofleadions.ACSAppl.Mater.Interfaces,2017,9,32591-32598.[150]ChalupniakA.,MerkociA.,Grapheneoxide-poly(dimethylsiloxane)-basedlab-on-a-chipplatformforheavy-metalspreconcentrationandelectrochemicaldetection.ACSAppl.Mater.Interfaces,2017,9,44766-44775.[151]ZhaoD.L.,SieboldD.,AlvarezN.T.,ShanovV.N.,HeinemanW.R.,Carbonnanotubethreadelectrochemicalcell:detectionofheavymetals.Anal.Chem.,2017,89,9654-9663.[152]LiuW.,DongH.,ZhangL.M.,TianY.,DevelopmentofanefficientbiosensorfortheinvivomonitoringofCu+andpHinthebrain:rationaldesignandsynthesisofrecognitionmolecules.Angew.Chem.Int.Ed.,2017,56,16328-16332.[153]ZhangX.W.,QiuQ.F.,JiangH.,ZhangF.L.,LiuY.L.,AmatoreC.,HuangW.H.,Real-timeintracellularmeasurementsofROSandRNSinlivingcellswithsinglecore-shellnanowireelectrodes.Angew.Chem.Int.Ed.,2017,56,12997-13000.[154]JeongS.,ParkJ.,PathaniaD.,CastroC.M.,WeisslederR.,LeeH.,Integratedmagneto-electrochemicalsensorforexosomeanalysis.ACSNano,2016,10,1802-1809.[155]XuH.Y.,ZhouS.,JiangD.C.,ChenH.Y.,Cholesteroloxidase/tritonX-100parkedmicroelectrodesforthedetectionofcholesterolinplasmamembraneatsinglecells.Anal.Chem.2018,90,1054-1058.[156]TianY.,MaoL.Q.,OkajimaT.,OhsakaT.,Acarbonfibermicroelectrode-basedthird-generationbiosensorforsuperoxideanion.Biosens.Bioelectron.,2005,21,557-564.[157]HuangW.H.,PangD.W.,TongH.,WangZ.L.,ChengJ.K.,Amethodforthefabricationoflow-noisecarbonfibernanoelectrodes.Anal.Chem.,2001,73,1048-1052.[158]LiT.,WangE.K.,DongS.J.,Lead(II)-inducedallostericG-quadruplexDNAzymeasacolorimetricandchemiluminescencesensorforhighlysensitiveandselectivePb2+detection,Anal.Chem.,2010,82,1515-1520.75 西南大学硕士学位论文[159]ShiY.,WangH.Y.,JiangX.X.,SunB.,SongB.,SuY.Y.,HeY.,Ultrasensitive,specific,recyclable,andreproducibledetectionofleadionsinrealsystemsthroughapolyadenine-assisted,surface-enhancedramanscatteringsiliconchip.Anal.Chem.,2016,88,3723-3729.[160]WangF.L.,WuZ.,LuY.X.,WangJ.,JiangJ.H.,YuR.Q.,Alabel-freeDNAzymesensorforlead(II)detectionbyquantitativepolymerasechainreaction.Anal.Biochem.,2010,405,168-173.[161]ZhuY.Y.,DengD.Q.,XuL.G.,ZhuY.B.,WangL.M.,QiB.,XuC.L.,UltrasensitivedetectionofleadionsbasedonaDNA-labelledDNAzymesensor.Anal.Methods,2015,7,662-666.[162]ZhuangJ.Y.,FuL.B.,XuM.D.,ZhouQ.,ChenG.N.,TangD.P.,DNAzyme-basedmagneto-controlledelectronicswitchforpicomolardetectionoflead(II)couplingwithDNA-basedhybridizationchainreaction.Biosens.Bioelectron.,2013,45,52-57.[163]KimJ.,LeeJ.B.,GiantcatalyticDNAparticlesforsimpleandintuitivedetectionofPb2+.NanoscaleRes.Lett.,2016,11:244.[164]PengY.,LinL.D.,YiX.H.,GuoL.,Label-freepicomolardetectionofPb2+usingatypicalicosahedragoldnanoparticlesandrollingcircleamplification.Biosens.Bioelectron.,2014,59,314-320.[165]ZhaoX.H.,KongR.M.,ZhangX.B.,MengH.M.,LiuW.N.,TanW.H.,ShenG.L.,YuR.Q.,Graphene-DNAzymebasedbiosensorforamplifiedfluorescence“turn-on”detectionofPb2+withahighselectivity.Anal.Chem.,2011,83,5062-5066.[166]ElbazJ.,ShlyahovskyB.,WillnerI.,ADNAzymecascadefortheamplifieddetectionofPb2+ionsorL-histidine.Chem.Commun.,2008,1569-1571.[167]LiuM.,ZhangQ.,ChangD.R.,GuJ.,BrennanJ.D.,LiY.F.,ADNAzymefeedbackamplificationstrategyforbiosensing.Angew.Chem.Int.Ed.,2017,56,6142-6146.[168]BrydaE.C.,PearsonM.,AgcaY.,BauerB.A.,Methodfordetectionandidentificationofmultiplechromosomalintegrationsitesintransgenicanimalscreatedwithlentivirus.Biotechniques,2006,41,715-719.[169]ZhaoY.Y.,ZhouL.,TangZ.,Cleavage-basedsignalamplificationofRNA.Nat.Commun.,2013,4:1493.[170]BrownA.K.,LiJ.,PavotC.M.B.,LuY.,Alead-dependentDNAzymewithatwo-stepmechanism.Biochemistry,2003,42,7152-7161.76 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硕士期间研究成果硕士期间研究成果1.WeiCai,ShunbiXie,YingTang,YaqinChai,RuoYuan*,JinZhang*,Alabel-freeelectrochemicalbiosensorformicroRNAdetectionbasedoncatalytichairpinassemblyandinsituformationofmolybdophosphate.Talanta,2017,163,65-71.(IF2016=4.162)2.WeiCai,ShunbiXie*,JinZhang,DianyongTang,YingTang*,AnelectrochemicalimpedancebiosensorforHg2+detectionbasedonDNAhydrogelbycouplingwithDNAzyme-assistedtargetrecyclingandhybridizationchainreaction.Biosens.Bioelectron.,2017,98,466-472.(IF2016=7.780)3.WeiCai,ShunbiXie*,JinZhang,DianyongTang,YingTang*,Immobilized-freeminiaturizedelectrochemicalsensingsystemforPb2+detectionbasedondualPb2+-DNAzymeassistantfeedbackamplificationstrategy.ManuscriptIDBIOS-D-18-00730(underrevision).78 致谢致谢时光匆匆，三年的硕士学习生活马上就要结束，即将毕业之际，我谨向我的母校、老师、同学、朋友、家人表达我最衷心的感谢。因为有你们的关心和支持，我才能开心、顺利地度过这三年的学习生涯。首先，衷心感谢我的恩师张进教授和师母唐英教授！是他们的言传身教，将我带入了分析化学的学术殿堂，为我提供了良好的研究平台。也是他们在我学习和生活中给予了无微不至的关怀和悉心指导，激励着我在科研道路上不断探索。师恩似海，终身难忘，真诚的祝愿二位恩师，身体健康，万事如意！感谢我的另一位导师袁若教授，感谢您不嫌我的懵懂无知，倾心培养，使我电分析化学及相关领域有所认识，并以此为基础不断的深入学习。同时，还要感谢唐典勇老师、谢顺碧老师给予的指导和帮助！无论从实验方案的拟定及实施，还是到后来论文提纲的设立、内容的撰写都给了我很多的建议，让我能够更有效的把握好研究的方向，不致于走太多的弯路。无数次的论文修改，老师都花费了很多的时间和精力，您对学生认真负责的态度、严谨的学术研究方式，都是我未来学习的榜样。在此向您致以最诚挚的敬意和谢意。感谢卓颖老师、柴雅琴老师、蔡艳华老师、霞碧云老师、安继斌老师等，感谢你们在学习中的指导和生活中的帮助。感谢梁文斌、王海军、郑莹宁、熊成义、王会军几位博士为我答疑解惑，感谢你们鼓励和支持。感谢我的师姐滕柳梅、吕静，师妹卿敏以及几位同门李雪、寇贝贝、杨绘耘、李孟洁的关心和帮助！有你们的日子，每天都很开心。衷心的祝福你们学业有成，前程似锦！感谢我的父母，我的家人，我的女友谢滢，因为你们的陪伴和理解，我才能够在我所选择的道路上一往无前，也因为你们的鼓励和支持，成为我最大的后盾，无论遇到什么问题，我总是能够积极的去面对和解决，坚持不懈的走下去。最后，再次衷心感谢所有支持帮助过我的人，谢谢你们！蔡维二零一八年四月于西南大学79
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