梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向消减cDNA文库的构建

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1、____________________________________________________________________________www.paper.edu.cn遗传学报，2003，30（7）：668-672梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向1消减cDNA文库的构建121*211徐德全，张义兵，熊远著，桂建芳，蒋思文，苏玉虹1华中农业大学农业部猪遗传育种重点实验室（430070）2中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室（430072）E-mail:xiongyzh@public.wh.h

2、b.cn摘要：以梅山猪和长白猪的背最长肌为材料，利用抑制性消减杂交技术，成功构建了梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向消减cDNA文库。以管家基因G3PDH作为消减指标，检测梅山猪105和长白猪两个消减文库的消减效率分别高达2和2倍，表明某些特异于两种肌肉组织的差异105表达基因的富集效率也分别接近2和2倍。从两个消减文库中分别筛选到了709和673个有效阳性克隆，PCR鉴定插入片段长度主要分布于150～750bp之间。不同猪种肌肉组织间消减cDNA文库的构建为进一步分离和鉴定影响肌肉生长和肉质的基因奠定了基础，对探讨肌肉生长机

3、理和肉质决定因素，以及应用于分子育种具有重要意义。关键词：猪肌肉组织差异表达基因消减cDNA文库抑制性消减杂交1．引言国内外猪种由于来源、长期所处的地理环境以及所接受的饲养方式和选育性状重点的不同，使其在肌肉的生长和肉质等方面各有优缺点。其中，梅山猪不仅以产仔数高闻名于世，[1]且肉质优于欧洲猪种，但其具有较低的日增重和瘦肉率以及较厚的背膘。合理利用这些差异，弄清这些差异的原因，将为猪育种提供有效的途径。细胞遗传学研究表明，中外猪种的染色体C带型、Ag-NOR多态性存在差异，甚至被公认[2]为比较稳定的G带型和Q带型也发现

4、多态的存在。分子遗传学研究更明确地表明中外猪种基[3]因组存在明显的差异，这些差异不仅包括单个碱基或少量碱基的不同，如FOS等；而且包含[4]较大片段的差别。但目前还很少有中外猪种基因表达水平差异的研究，而研究中外猪种基因表达的差异是弄清导致中外猪种性状差异原因的重要途径之一。抑制性消减杂交[5]（SuppressionSubtractiveHybridization，SSH）技术是继mRNA差异显示（mRNA[6]DifferentialDisplay，DD）技术和代表性序列差别分析（RepresentationalDi

5、fference[7]Analysis，RDA）技术之后又一新的表型克隆技术，其克服了DD技术假阳性率高和RDA技术消减杂交轮次较多的缺点，且对高、低丰度的差异表达基因都可有效分离。利用其研究中外猪种基因表达水平的差异，将对中外猪种性状差异原因的探讨具有重要的意义。[8]猪骨骼肌基因对猪肌肉的生长和肉质具有重要的决定作用。本研究利用SSH技术构建了梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向消减cDNA文库，用于中外猪种肌肉生长和肉质差异的研究。试图通过分离和鉴定影响猪肌肉生长和肉质的重要基因，弄清不同猪种间肌肉生长和肉质差异的遗传基础

6、，丰富人们对肌肉生长和肉质形成机理的认识，并将所分离和鉴定的基因直接应用于猪的育种研究。2．材料和方法2.1猪肌肉样的采集实验用肌肉样采自华中农业大学精品猪场的同日龄梅山猪与长白猪的背最长肌，置液氮1本课题得到863国家高技术研究发展计划（项目编号：2001AA213121）和973国家重大基础研究项目（项目编号：G2000016105）资助；*为通讯作者。1____________________________________________________________________________中国科技论文在

7、线www.paper.edu.cn遗传学报，2003，30（7）：668-672备用。每品种采集3头，每头选自不同窝次的最接近窝平均重的2月龄母猪。2.2方法2.2.1肌肉总RNA的提取及mRNA纯化根据RNAExtractionKit（Pharmaica公司）操作手册，利用三氟乙酸铯盐(CsTFA)密度梯度超速离心法提取3头梅山猪与3头长白猪背最长肌的总RNA，并分别混合形成梅山猪与长白猪的RNApools。随后利用磁珠法（Promega公司）从RNApools中分离、纯化mRNA。2.2.2抑制性消减杂交具体操作按照P

8、CR-SelectcDNASubtractionKit（Clontech公司）进行。首先分别制备梅山猪和长白猪肌肉组织的DrivercDNA和TestercDNA。DrivercDNA的制备是：梅山猪和长白猪肌肉组织mRNA逆转录合成双链cDNA，然后用RsaⅠ充分酶切3h后完成。TestercDNA的