新城疫热稳定性天然弱毒B95株融合蛋白基因的克隆及其核酸疫苗的构建

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1、河北农业大学硕士学位论文新城疫热稳定性天然弱毒B<,95>株融合蛋白基因的克隆及其核酸疫苗的构建姓名：侯绍华申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：裘孝良2003.5.1本人声明所里交的学位成果。据我所知，除了文中经发表或撰写过的研究成果的学位或证书而使用过自q材独创性声明在论文中作了明确的说明并表示谢意。得的研究其他人已教育机构贡献均已学位论文作者躲像螂2签字嗍删年／月枷学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解丝i；生鏖生茎盛有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向和借阅。本人授权关数据库进行检索(保密的学位论文在解密后使用本受权书)学位论文作者签名：f：雾绍华签字日期删年夕

2、月渊‘论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅以将学位论文的全部或部分内容编入有扫描等复制手段保存、汇编学位论文。导师签名：签字日期月岁弘目塑j!查些奎堂堡主望兰丝苎—————————————一摘要利J}j从国外引进的新城疫熟稳定性天然弱毒1395株接种SPF鸡胚繁殖病毒，经处理后提取病毒的基因纽RNA，参考国内外发表的NDV融合蛋白基因序列，设计一对特异性引物．经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出约1700bp大小的特异性片段，将此片段回收纯化后，利用T_A克隆技术将其克隆到PGEM-T．-easy克隆载体中，再转化人肠杆菌JMl09感受态细胞。转化后经分子量比较、PCR鉴定和酶切分

3、析筛选ml性克隆．结果表明，所得到的伢1性重组子(PEGM—F)中含有新城瘦热稳定性大然弱霉B”株F基阔。经核苷酸测序，该基冈含一个1662bp的开放阅读框，编码553个氨基酸，与国外报导的新城疫各毒株F基冈相比，核苻酸序列同源性为88．3％-～96．4％．氨基酸同源性为92．1e／一96．4％。氮基酸的差异主要集中在N端1．32残基，该序列为F蛋向的信号序列，在F蛋舟新生多肽与囊膜泡结台后不久被切F米，冈此他不是功能性F蛋白的构成成分，所承受的进化强制就很小。将止确的重组克隆质粒PGEM—F埘Notl单酶切，电泳同收纯化目的片段，与同样州Notl单酶切井经去磷艘化处理的真核表达载体Pe

4、DNA3．1连接，转化大肠杆菌JMl09感受态细胞，得到的转化子经PCR鉴定和酶切分析，筛选出符合阅读框的重组子，构建成新城痰核酸疫苗，并用所构建的新城疫核酸疫苗与制备的裁基因阳离子脂质体结合进行免疫实验，通过ELISA试验、淋巴细胞转化试验等检铡核酸疫苗在鸡体内的表达，表达产物作为抗原物质刺激机体产生了特异性应答反应，引起了机体特异性的体液免疫和细胞免疫，对新城疫强毒的攻击具有75％保护率，为进一步研究重组疫苗奠定了一定的基础。关键词：新城痰病毒(NDV)：基冈克隆：真核表达：B95株：融合蛋白基冈(Fgene)脂质体塑!!奎些查堂堡圭兰些兰苎—————————————一文献综述新城疫

5、病毒分子生物学研究进展新城疫(№％硎eDisease．ND)是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一，自1926年酋发于印度尼西亚和英国新城11j以来，在其近80年的历史中，新城疫在全世界曾发生过多次大流行‘2。i。近年来虽无世界性流行，但区域性爆发新城疫的报道却屡见不鲜，过去我国许多地区每年都有此病的发生，造成了很大的经济损失。有文献报道在1500例病毒病中，NDV占450,／0[41。据农业部估计，我国每年因各种禽病造成的经济损，大高达数十亿元，其中NDV占了近lO嘣”。80年代前后由于预防j：作已成为生产常规，流行渐少，许多省区基本上控制了这种疫病pJ。但近年来随着经济的发展和交往的

6、频繁，新的流行又有抬头的趋势，而且出现了许多新的特点，表现为：症状、病变不明显的非典型新城疫【6’“8‘”：宿主范嗣扩大，据文献报道已从多种禽类包括水禽分离到新城瘦强毒l}“111：发病率、死亡率不高，主要表现呼吸及神经系统碌僻；免疫火败报道增多．甚至抗体滴度较高(2。’)的鸡群也可发病”“：混合感染增多等．使新城疫此起彼伏。给防制带来了更大的困难。另一方面，由丁新城疫疫苗的使埘比较溜乱，中等毒力、弱毒、灭活苗同时使用，这样不仅易于病毒的教播而且给新城疫的检疫尤其是口岸检疫和痰情的监测带来了很大麻烦．上述情况表明。新城疫仍然是妨碍养禽业发展的重大疾病之一，因此有必要对新城疫病毒从分子生物

7、学水平上进行更深一步的研究，积极探索防制新城疫的新手段和新方法．一．新城疫病毒的分子生物学特点及致病基础新城疫病毒(NDv)是副粘病毒科、腮腺炎病毒属的成员，完整的病毒粒子近球形，直径一般为120-300rim，病毒粒子中心是一个与蛋白质相连接的单股负链RNA所形成的螺旋形核衣壳，外包一双层脂质囊膜，内衬有一层特殊的M蛋白，囊膜外有大小两种糖蛋白纤突，前者具有血凝素和神经氨酸酶话性的HN蛋白组成，后者具有融合功能的F蛋白组成．病毒的