猪o型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建论文33514

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1、猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建目录摘要III关键词IIIAbstractIIIKeywordsIII英文缩略词表IV1前言11.1口蹄疫的基本特征11.1.1口蹄疫病毒基本概念11.1.2口蹄疫病毒生物学特征11.1.3口蹄疫病毒危害11.2泛素蛋白及其对抗原的影响21.3siRNA干扰机制31.4γ干扰素与口蹄疫免疫41.5FMD疫苗研究进展51.6本实验研究的目的与意义62实验材料62.1菌种、毒株、载体与质粒62.2主要药品与试剂62.3主要培养基及配制72.4缓冲液及其配制72.5其他溶液72.5空斑筛选与纯化相关试剂82.6寡核苷酸引物83实验方法83.1转移载体PIEC

2、MVUbiP1P1SiFIFNγ的构建策略83.1.1限制性内切酶酶切反应93.1.2酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测93.1.3酶切产物的回收93.1.4回收产物的去磷酸化反应93.1.5目的基因与载体的酶连反应93.2感受态细胞的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化103.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）103.2.2质粒的转化103.2.3质粒的小量制备（OMEGA试剂盒）103.2.4质粒的大量制备（OMEGA试剂盒）113.2.5阳性质粒的酶切鉴定113.3以PRV为载体表达FMDV抗原蛋白基因P1，泛素蛋白与抗原P1的融合基因Ubi-P1，RNA干扰基因shRNA，干扰素基因

3、IFN-γ的重组病毒的构建123.3.1细胞的培养、冻存与复苏123.3.2PRVTK-/gE-/LacZ+基因组DNA的提取123.3.3脂质体介导的共转染133.3.4重组病毒空斑纯化和PCR鉴定13III猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建3.3.5鉴定用PCR模板处理143.3.6重组病毒PCR鉴定144结果与分析154.1转移质粒PIECMVUbiP1的构建154.2转移质粒PIECMVUbiP1P1的构建154.3转移质粒PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ的构建164.4共转染产物接毒第三代PCR鉴定174.5重组病毒的空斑纯化及PCR鉴定184.5.1空斑的形成184

4、.5.2在PK-15细胞上的第一轮空斑筛选194.5.3在Vero细胞上的第一轮空斑筛选204.5.4重组病毒的空斑筛选结果205讨论205.1载体的构建205.2细胞的传代培养215.3空斑筛选实验215.3.1空斑筛选细胞的选择215.3.2RNA干扰对空斑筛选结果的影响225.3.3干扰素γ对空斑筛选结果的影响22参考文献：22致谢24III猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建TheconstructionofrecombinatVirusforGeneratingaNovelGeneticEngineeringVaccineAgansitOT

5、ypeFMDVofPig摘要口蹄疫是一种急性、高度传染性的病毒性传染病，虽自20世纪初口蹄疫疫苗已经在世界部分地区应用，但目前全球口蹄疫疫情依然严重，也构成了世界动物及动物产品贸易的障碍。由本实验室构建的猪伪狂犬病毒基因缺失株PRVTK-/gE-/LacZ+作为一种病毒载体，具有安全性好、容量大、重组效率高等优点，本研究用人工合成的O型口蹄疫P1基因作为抗原基因，用和泛素（Ub）融合的UbiP1作为另一个抗原基因同时达到增强细胞免疫效果，再将针对口蹄疫3B基因设计的shRNA和具有抗病毒及免疫调节效果的猪IFN-γ与以上两个功能基因串联，构建了具有四个功能基因的转移载体，将此转移载体和PR

6、V缺失株TK-/gE-/LacZ+共转染细胞，发生基因重组后进行了空斑纯化，经鉴定，初步得到了含有P1基因、UbiP1、shRNA、IFN-γ四个功能基因的重组伪狂犬病毒，为进一步构建新型基因工程疫苗打下基础。关键词：抗原基因；泛素蛋白基因；干扰素基因；重组病毒AbstractFootandmouthdisease(FMD)isanacute,highlycontagiousvirulinfectiondisease.Althoughvaccines,availablesincetheearly1900s,havebeenusedinpartsoftheworld,thediseasest

7、illisaseriousglobeoutbtreakandbecomesanitarybarriertothecommerceofanimalsandanimalproducts.ThevectorvirusPRVTK-/gE-/LacZ+,constructedbyourlaboratory,hastheadvantagesofsafety,highcapacity,highrestructuringefficien