抗嗜水气单胞菌NJ1感染的乳酸菌筛选及其免疫调节作用

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1、第40卷第3期水产学报Vol.40,No.32016年3月JOURNALOFFISHERIESOFCHINAMar.,2016文章编号:1000–0615(2016)03–0396–08DOI:10.11964/jfc.20150910074抗嗜水气单胞菌NJ-1感染的乳酸菌筛选及其免疫调节作用王彦波1，任真真1，张岩2，傅玲琳1*(1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品微生物技术研究重点实验室，浙江杭州310018；2.河北省食品检验研究院，河北石家庄050091)摘要：为了筛选能提高水产动物对嗜水气单胞菌抗病性的益

2、生菌，并研究其免疫调节的作用机制。将5种乳酸菌与斑马鱼ZF-4细胞共培养后通过荧光定量PCR方法检测细胞因子NFκB、TNF-α和IL-10的表达量，并用流式细胞仪检测被嗜水气单胞菌NJ-1攻毒后的细胞凋亡率来筛选对ZF-4细胞保护性最显著的乳酸菌，将其添加至模式生物斑马鱼饲料中饲喂28d后，用嗜水气单胞菌NJ-1攻毒并检测斑马鱼肠道中促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和抗炎性细胞因子IL-10的表达情况，并计算斑马鱼被攻毒后的累积死亡率。结果显示，5种乳酸菌分别与细胞共培养后，芽孢乳酸菌09.712能明显提高ZF-4细胞N

3、FκB、TNF-α和IL-10的表达量，攻毒后细胞凋亡率降低至23.36%，与其他组相比存在显著性差异，所以选取芽孢乳酸菌09.712用于下一步实验。体内实验显示，攻毒后第1天，与对照组相比，芽孢乳酸菌09.712能显著促进斑马鱼肠道内IL-1β、TNF-α和IL-10的表达量，且随时间变化表达量减少；其中攻毒后第3天，菌饲喂组IL-1β表达量比对照组低，而IL-10表达量明显比对照组高。此外，芽孢乳酸菌09.712的饲喂显著降低斑马鱼攻毒后的死亡率。研究表明，芽孢乳酸菌09.712在体外能显著提高对细胞的保护性，在体内能诱导

4、斑马鱼产生先天免疫应答，提高斑马鱼的免疫力，可作为预防水产动物疾病的理想选择，也为阐明乳酸菌先天性免疫调节作用提供理论基础。关键词:嗜水气单胞菌；乳酸菌；ZF-4细胞系；斑马鱼；免疫调节；细胞因子中图分类号:S917.1文献标志码:A在水产养殖中，疾病的频繁暴发严重影响并菌能显著提高水产动物的免疫力[5]及其对病原菌制约其产量和经济的发展[1]。长期以来，传统的的抗感染能力[6]。但是，乳酸菌在体内与体外对消毒剂和抗菌药物等在预防和治疗水生生物疾机体免疫调节作用的一致性还有待进一步的研究。病等方面的作用有限，因为对抗生素产生耐

5、药斑马鱼(Daniorerio)由于其体积小，繁殖力强，性的细菌种类不断增加，而且抗生素的使用也生长速度快，在生理、基因结构功能等方面与涉及到食品安全等问题[2]。益生菌可以抑制病原高等动物具有高度相似性等优点[7]，被广泛用于菌的生长和对肠黏膜的侵袭[3-4]，而且具有无免疫学的研究[8-10]。本实验以斑马鱼为模型，采毒、无残留、无抗药性、不污染环境、成本低廉等优势，是抗生素的理想替代品。因此，筛用体外细胞实验，从5种乳酸菌中筛选出对斑马选出能明显提高水产品先天或获得性免疫系统鱼胚胎上皮细胞(ZF-4)有明显免疫保护作用的

6、种能力的益生菌显得尤为重要。实践证明，乳酸类。收稿日期：2015-09-11修回日期：2015-12-24资助项目：国家自然科学基金(31571770，31571913)；浙江省自然科学基金(LY14C200001，LZ15C200001)通信作者：傅玲琳，Email:fulinglin@mail.zjgsu.edu.cnhttp://www.scxuebao.cn3期王彦波，等：抗嗜水气单胞菌NJ-1感染的乳酸菌筛选及其免疫调节作用3971材料与方法并将裂解液直接提取RNA或储存于–80°C冰箱中。其余每组3个细胞培养孔加入

7、新鲜的细胞培养基，然1.1细菌菌株与细胞的来源后加入嗜水气单胞菌NJ-1至终浓度为107CFU/mL，诱导细胞凋亡4h。使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡芽孢乳酸菌09.712(Bacilluscoagulans检测试剂盒检测每个处理组中细胞的凋亡率。09.712)分离于豆豉(Merrill)，植物乳杆菌08.923(Lactobacillusplantarum08.923)分离于发酵1.5斑马鱼的饲养及饲料的制备乳(fermentedmilk)，由浙江省重点实验室分离保斑马鱼的饲养：AB系斑马鱼大约4月龄，平存；鼠

8、李糖乳杆菌CGMCC1.372(L.rhamnosus均体质量(1.5±0.24)g，平均体长(3.0±0.5)cm，购CGMCC1.3724)、嗜热链球菌CGMCC于国家斑马鱼资源中心。斑马鱼的养殖条件：1.2471(StreptococcusthermophilusCGM