前列腺癌患者噬菌体抗体库的构建

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1、中山大学硕士学位论文前列腺癌患者噬菌体抗体库的构建姓名：赵风进申请学位级别：硕士专业：泌尿外科学指导教师：黄健2003.5.20翦戮隙薅患者瑾蘩露按体痒瓣构建孛出文学碛士学位论文前列腺癌患者噬菌体抗体库的构建学位申请入：赵风迸导师：黄健教授中山大学醛壤第二医蒎泌屎步}科摘要』研究背景：f前列腺瘸(ProstateCarcinoma)蹩男性常觅的恶後肿癌，且随着入嗣平均寿命的延长，发病率璧明显上升的趋势，前列腺癌患者的诊治已成为沉重的社会、经济负担。虽然早期前列腺瘸采用根治性切除效果较好，但早期翦列艨癌临床症状不明湿，约弱％以上的

2、瘸入确诊对融属魄期，不逶合行校渗性手术，只能采用内分泌治疗、放疗及化疗等治疗方法，治疗效巢不佳。内分泌治疗包括睾丸切除术和抗雄激索药物治疗，治疗后约80％病人症状缓解，n易产生激素I#铱赖型肿瘤，最终导致内分泌治疗失效。化疗可作为雄激素I#依赖型瓣瘤的治疗方法，毽蓠捌艨癌耀熬对纯疗不敏感，蛊毒性大，瘸人难以忍受，并且有时因病入条件陵伟《不能耐受。放射治疗可赢接杀死胂瘤细胞，是目前公认的治疗前列腺癞的有效方法，但放疗只能在肿瘤局部超作用，对转移瘫灶裳掌无法璇及。野此，翦列腺癞的早期诊叛秘及时治疗对魏列腺瘸患者静预螽有{#警重要的舔

3、床意义。l篼辨，发震耨酌方法戳浓疗餐蘸治疗方法疗效不住的病例，也有着广阔的应糟前景。以抗肿瘤单克隆抗体为载体进行肿瘤导向治疗一或是～热门课题，其中放射兔疫导自治疗的应用最广，北方法特巽牲裹、操佟方便、对正常组织损伤小。诧夕}，利箱抗静瘤鼙克隧抗体，还可掰予瓣瘤龄放辩免疫攫像，绫确定肿瘤的转移，来判断分期及制定治疗方案。很明显，在肿瘸的放射免疫最豫及派疗中单克隆摭体是关键因素之～。目翁脞瘤导向治疗的效果还不令人满意，其中一个重要原因就是单壳隆抗体仍存在一些蠲题，懿鼠源靛、特异性不商、亲和力不谚、分子量太大等。前列腺癌患者噬菌体抗体

4、库的构建中山大学硕士学位论文80年代中期以来随着基因工程技术的发展，出现了抗体库技术，即用细菌克隆取代B细胞克隆来表达抗体谱，它综合运用了以下科学发展：(1)能用PCR(PloymeraseChinReaction)来分离抗体可变区基因：(2)能在细菌中表达功能性抗体片段：(3)建立了高效的抗原筛选系统，而可以从抗体谱中筛选到针对各种抗原的特异性抗体(片段)。这项技术的一个突破性进展就是表面表达的噬菌体抗体库(Surfacedisplayantibodylibrary)即噬菌体表面呈现技术，它在筛选时检测的不是细菌克隆的可溶性表

5、达产物，而是噬菌体载体转化细菌后，融合表达在噬菌体颗粒表面的Fab或ScFv，称为噬菌体抗体，通过多轮的抗原吸附．洗脱-扩增，最终筛选到所需的抗体克隆，大大简化了筛选过程。利用抗体库技术可以产生人源性抗体，彻底解决了人抗鼠抗体反应(Humanantimouseantibody，HAMA)问题，增强放射免疫治疗的效果，并且可以通过链替换、定点突变等方法来提高抗体亲和力，从而解决以往基因工程抗体所存在的一些缺陷。鉴于对前列腺癌的诊断及治疗手段的迫切要求，本研究利用抗体库技术在国内首次构建了前列腺癌患者Fab片段噬菌体抗体库，以期将来

6、获得抗前列腺特异性膜抗原的Fab片段，为该抗体片段的动物实验及l临床试验创造条件，为前列腺癌的诊治提供一种新的途径。j。。，(／7研列目的：／本课题拟扩增前列腺癌患者体内的免疫球蛋白轻链和重链Fd片段的基因并克隆入噬粒载体pComb3，从而构建前列腺癌患者的噬菌体抗体库，为抗体Fab片段的筛选、动物实验、临床试验奠定基础。，／材料和方法：l1．材料：1．1菌株、噬菌粒和辅助噬菌体大肠杆菌XLl一blue、噬菌粒pComb3、辅助噬菌体VCSMl3。1．2培养基：胰蛋白胨、酵母提取物(OXIOD)，MOPS(AMRESC0)，琼脂

7、粉(Serva)1．3试剂裁剥骧癌患者躐燕嚣摈转痒豹构建中趣大学硬蠹学位论文TRIZOL试剂、逆转袋试刹鑫魏塞Invitrogen公司；Taq酶、缀零l髅核酸肉切酶(SacI和XbaI，XhoI和SpeI)购自Promega公司；凝胶DNA回收kit和质粒提取kit为Qiagen公司试剂盒。1．4摭生素：四环索(tet)、氨苄青霉素(amp)、羧苄青霉索(carb)、卡那霉索(kan)(AMRESCO)；1．5葵谴：PCR引物(见表1-2)、PEG8000、琼月肇糖(Promega)、九一HindIlldigested公子质艟标

8、准、DL2000分子质量标准等。2．方法2．1港巴缡藏总RNA嚣援彀以本院泌尿外葶斗前列腺癌患者为采血对象，用潞巴细胞分离液分离淋巴细胞，按TRIZOL试荆的说明书操作提取总RNA。2．2遴转录、PCR按1NVITROGEN公司的逆转录试剂盒说明书操作，以总RN