《RNAi干扰及其应用》PPT课件

《《RNAi干扰及其应用》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、RNAi的发现20多年前，在对矮牵牛（petunias）进行的研究中有个奇怪的发现：RichJorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮脚牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待中的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen将将这种现象命名为协同抑制“cosuppression”，因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。后来发现在其他许多植物中，甚至在真菌中也有类似的现象。野生型试验预测1995年，GuoS等试图阻断秀丽新小杆线虫（C.elegans）中的par-1基因的表达。设计：反义RNA特异性地阻断par-1

2、基因的表达；正义RNA以期观察到基因表达的增强。结果:二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。RNAi的提出直到1998年2月，FireA和MelloC才首次揭开这个悬疑之谜。他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。他们证实，GuoS博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。该小组

3、将这一现象称为RNA干扰（RNAinterference，简称RNAi）。RNAi广泛存在于自然界随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。RNAi的定义目前对RNAi(RNAinterference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：①RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参

4、与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。②RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。如果将其作为一门生物技术，则定义为：①RNAi是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA和反义RNA),从而诱导内源靶基因的mRNA降解,达到阻止基因表达的目的。②RNAi是指体外人工合

5、成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的mRNA降解成21nt～23nt的小片段，使相应的基因沉默。③RNAi是将与靶基因的mRNA同源互补的双链RNA(dsRNA)导入细胞,能特异性地降解该mRNA,从而产生相应的功能表型缺失,属于转录后水平的基因沉默(post-transcriptionalgenesilence,PTGS)。RNAi的定义1、RNAi机制体外实验结果的提示体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。从已经发生RNAi的果蝇S2

6、细胞中，Hammond等人部分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该呢？由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21-23核苷酸长的dsRNA片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，人们提出一种RNAi作用的简单模型。RNAi作用的简单模型当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA

7、。识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。RNAi引发的基因沉默机制GiselaStorz,Science,296(5571):1263-1265,2002.RNAi相关的基因沉