黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因lipC转录调控因子的研究

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1、护17l『大学博士学位论文题目：董孢愿墨垩堇菌查亟塞过氢丝堑酶基因《垃￡2蛰量道控固王的盟窒培养单位：．生佥抖堂堂随一．指导教师：一．殛竖垂麴攮一专业：遗僮鲎研究方向：坌壬遗佳堂盈薹国王握授予学位时间：——年一月一日婴型查堂塑主兰垡堡苎重塑堕墨兰兰堕查重壅堇墼些塑堕薹堕!生旦!壁茎塑丝望三箜堑塞为进一步鉴定酵母单杂交筛选到的阳性克隆与顺式元件的结合作用，利用pET-28a载体对筛选到的14．3．3蛋白编码序列进行原核生物表达，SDS．PAGE分析表明，14．3．3蛋自在Escherichia．coEBL21中以部分包涵体和部分可溶性形式存在，分子量为33kD

2、。通过Ni柱纯化得到E．coli中可溶表达的14．3。3蛋白，并用透析和PEG20000浓缩该蛋白用于体外结合实验(GMSA)。表达的14．3．3蛋白与32P标记的PBEt+PBE2探针混合后，经低离子强度聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射自显影表明，1舢3．3蛋白电泳有明显的延迟现象，当加入40倍的冷探针后，延迟现象减弱，加大14．3．3蛋白量后，延迟现象增强，表明14．3．3蛋白可以与该探针特异结合。在上述研究工作基础上，以14．3．3蛋白为钓饵，利用酵母双杂交技术筛选Pchrysosporium3deDNA文库，在SD／。Ade／．His／-Leu／-Trp缺陷

3、培养基平板上共获得了约601个单克隆。进一步分析发现，只有少部分克隆可激活3个报告基因。分离自这些克隆中的质粒DNA转化大肠杆菌，利用HaelII和Sau3AI限制酶切分析可将其分为9类。序列测定和同源分析结果表明，测定的6个序列均具有多个潜在的磷酸化位点，也是14．3．3蛋白潜在的结合位点。其中有2个序列具有WD结构域，表明14．3．3蛋白在Pchrysosporium中也是一个多功能蛋白质。Y2H147与转录因子有一定相似性。高级结构分析显示，P．chrysosporium中的14，3．3蛋白与其它物种中的一样，含有9个Helix结构，且可以形成杯状的同

4、源二聚体结构。蛋白质．蛋白质预测结果显示，14．3—3蛋白可以与Y2H147、389、412号克隆结合，推测14。3．3蛋白在Pchrysosporium中参与多个细胞过程，尤其在基因转录调控过程中发挥某种作用。另外，RT-PCR分析表明14．3．3基因在P．chrysosporium不同代谢阶段没有明显的转录差异。关键词：黄孢原毛平革茵，酵母单杂交，酵母双杂交，14．3．3蛋白，转录因子，凝胶延迟电泳，木质素过氧化物酶基因Xn四川大学博士学位论文黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因(1ipC)转录调控因子的研究StudiesonTranscriptional

5、RegulationFactorsofLigninPeroxidaseGene(却C)ofPhanerochaetechrysosporiumAbstractThewhite·rotbasidiomycete-Phanerochaetechrysosporiumisallexcellentmodelorganismforstudyingthemechanismofliguinbiodegradation．Duetotheexcellentabilitytodegradelignin,aSweltasrelatedcompoundsfoundinexplosi

6、vecontaminatedmaterials，P．chrysosporiumisgreatlypotentialinbio-pulpingandenvironmentalprotection。Theextraeellularligninolyticsystemisacomplicatedprocessandeomprisesmanyenzymes，includingliguinperoxidasesandmanganeseperoxidases．NorthernblotandRT—PCRanalysesrevealedthatthetranscriptio

7、noflipsandmnpsareregulatedbynutrientssuchascarbonandnitrogen，etc．Thepreviousinvestigationsshowedthattwonuclearproteinbindingsites，namedPBElandPBE2，locatedupstreamofthetranscriptioninitiationsiteofthetipCgene．Therefore，itisveryimportanttoclonethegenesencodingthetranscriptionalregula

8、torsoflipgenesexpression．F