脂质胞壁酸诱导的延迟预适应对缺血再灌注损伤的作用

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1、华中科技大学博士学位论文脂质胞壁酸诱导的延迟预适应对缺血再灌注损伤的作用姓名：马世玉申请学位级别：博士专业：药理学指导教师：向继洲2003.5.1华中科技大学同济医学院2003届博士学位论文论文摘要l迄今，减少实验性缺血／再灌注损伤(ischemia／reperfusion，I／It)的最有效的方法是预适应(preconditioning，PC)。大多数研究表明药物诱导的延迟预适应具有很多优点：(1)不仅减少缺血组织的梗死范围，还能改善缺血后组织器官的功能紊乱；(2)可持续较长时间，且容易控制剂量，方便执行，适宜临床应用；(3)无缺血预适应可导致心

2、肌顿抑、心律失常，潜在增加缺血症状等风险。因此，寻找新型的预适应药物是当前治疗I／R损伤的一个重要研究领域。脂质胞壁酸(1ipoteichoicacid，LTA)是革兰氏阳性细菌的细胞壁成分，为两性分子结构。2000年，Zacharowski等首次实验研究发现，预先给予大鼠低剂量的L1'A(1m鲫唔ip)后8到24小时，能明显减少I／R导致的心梗梗死和组织损伤，但并不引起明显的副反应，如激活血小板凝聚级联反应，导致中性粒细胞聚集和粘附，以及肝、肾损伤等。因此有必要进～步探索其保护其它器官和细胞的作用及可能机制。j本文的目的是研究L11A诱导的延迟预

3、适应对大鼠心肌停搏再灌注损伤、培养的人冠状动脉内皮细胞(humancoronaryarteryendothelialceils，HCAECs)缺氧／再复氧损伤及大鼠局部脑缺血／再灌注损伤的保护作用。本文假定一氧化氮(nitricoxide，NO)和一氧化氮合酶在延迟预适应中可作为启动和／或中间递质发挥关键的作用。在不同的I／R模型，NO／NOS系统可能起不同的作用。另外，抑制细胞凋亡参与了延迟预适应的保护作用机制，而Bcl．2(抗凋亡蛋白)和核因子．r．B0师．姐)抑制细胞凋亡的两个重要因素。由此，本文重点研究NO／NOS系统和抑制细胞凋亡是否参与

4、了LTA诱导的延迟保护作用。／为模拟不同条件下的缺血／再灌注损伤，本文将采用以下三种模型：IX兰!型塾查兰旦塑墨兰堕!!塑堡塑主堂垡笙茎(1)心肌缺血／再灌注损伤的外科手术模型：大鼠离体心脏经停搏液停搏后，在Eurocollin氏液中保存4小时，而后用langendorff灌流模型恢复灌流。(2)整体大鼠脑局部I／R模型：大鼠右大脑中动脉(MCA)暂时闭塞2小时，而后再恢复血液灌流24小时。为诱导整体动物延迟预适应，大鼠在施行实验处理(缺血)前24小时腹腔注射LTA(1mg／kg)。(3)体外模拟缺血／再灌注损伤的模型：培养的HCAECs在含94％

5、氮气／5％二氧化碳／1％氧气的缺氧条件下培养2小时，然后在常氧条件下复氧培养2小时。为诱导HCAECs延迟预适应，HCAECs在含LTA(30肛g几or300鹇几)的培养基中培养4小时，更换新鲜的培养基后恢复培养24小时，然后进行实验处理。结果表明，LTA诱导的延迟预适应能明显改善I／R导致的组织和细胞损伤，具体表现在：(1)在离体灌流心脏，采用PowerLab数据采集系统分析灌流心脏停搏前和再灌注30分钟、60分钟的左心功能变化，LTA预适应明显增加再灌注后心脏的冠脉流量(CF)，提高左室发展压(LVDP)及压力最大上升和下降速率(±dpldt。

6、。)(P<0．01)，同时能显著减少再灌注末CK-MB和LDH的漏出(P<0．01)，降低心肌细胞凋亡指数(P<0．01，TUNEL染色法)。．LTA预适应能显著增加灌流液中NO含量(P<0．01)并上调iNOSmRNA的表达(增加iNOS／GAPDH的比值，RT-PCR方法)，减少I-r．B&的表达(蛋白质印迹技术)。此外，联合给予LTA和非选择性NOS抑制剂L-NG一硝基精氨酸甲酯(工一NAME，10mg／kg)腹腔注射能明显减少NO的产生和iNOSmRNA的表达，取消LTA预适应的保护效应。然而单独给以L—NAME并不导致任何观测数据的显著变

7、化。(2)在培养的人冠状动脉内皮细胞，LTA00¨g／Land300肛g／L)NX华中科技大学同济医学院2003届博士学位论文适应能显著减少台盼蓝排斥实验中的细胞死亡百分比俨<0．05，P<0．01，)，降低复氧末细胞培养液中LDH的含量(P

8、s的eNOSmRNA表达明显增加，而在本实验中始终未能检测到iNOSmR_NA的表达。同心肌预适应，LTA对内皮细胞的预适