脂联素对apap诱导小鼠急性肝损伤的保护作用

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1、温州医学院硕士学位论文脂联素对APAP诱导小鼠急性肝损伤的保护作用姓名：龚琦申请学位级别：硕士专业：中药学指导教师：李校堃；林灼锋2012-05-22脂联素对APAP诱导小鼠急性肝损伤的保护作用中文摘要目的：对乙酰氨基酚(APAP)是临床上常用的解热镇痛药，长期或过量使用可引起机体的肝脏损伤，本文通过功能获得和功能缺失的方法，即外源性给药和基因敲除的方法，阐明脂联素(APN)对APAP引起的小鼠肝脏损伤的影响，并进一步探讨其作用机制。方法：(1)APAP作用后对小鼠肝脏的影响及机体脂联素的变化取

2、10只8周龄雄性C57BL／6jWildtype小鼠随机分为两组，其中一组腹腔注射0．5mlAPAP(500mg／kg)，另一组注射相同体积PBS为对照，分别在注射前(0h)及注射后2h、4h、6h、12h、24h从尾静脉收集其血液样品，48h后处死上述两组老鼠，收集其血样及各组织。观察APAP处理后小鼠肝脏损伤的变化状况：采用全自动生化仪对血清中ALT、AST水平进行测定、H&E染色观察组织形态学变化；同时，观察APAP处理后小鼠血清中APN的变化状况，采用Q—PCR的方法检测小鼠相关组织中脂

3、联素mRNA水平变化。(2)外源性重组APN对APAP诱导小鼠急性肝损伤的影响取10只8周龄雄性C57BL／6jWT小鼠随机分为两组，一组经尾静脉注射0．1mlAPN重组蛋白(1．5mg／m1)，另外一组注射PBS为对照，分别于注射前(oh)及注射后1h、2h、3h、4h、6h从尾静脉收集其血液样品，采用ELISA方法检测APN处理后体内APN代谢的变化；另取上述相同小鼠分为两组，其中一组经尾静脉注射O．1ml重组APN蛋白(1．Smg／m1)，另一组以注射PBS为对照，半小时后两组小鼠再同时给

4、予腹腔注射lml籼(800mg／kg)，于APN或PBS注射前(oh)及之后2h、4h、6h从尾静脉收集其血清样品，并于8h时处死小鼠，收集其血清及肝脏组织，检测血清中APN、ALT、AST的变化情况，H&E染色观察其组织形态学上的差异，采用TUNEL检测试剂盒检测其肝脏组织中凋亡的大小，并采用westernblot的方法检测caspase3活性的变化。(3)APN基因缺失后APAP对其小鼠急性肝损伤的影响取10只8周龄雄性C57BL／6j脂联素基因缺失(APNKO)小鼠，同时以相同年龄及背景的

5、WT小鼠作为对照，每组小鼠以腹腔注射的方式给予lml的’5温州医学院硕士学位论文脚(900mg／kg)，观察36小时内两组小鼠存活率的多少；另再各取5只8周龄雄性APNKO及WT对照组小鼠，腹腔注射lml的APAP(500mg／kg)作用12h后收集其血样及肝脏组织，观察血清中ALT、AST的变化，组织形态学的改变及凋亡的大小，采用相关检测试剂盒检测各组小鼠肝脏GSH、ROS的变化，同时采用westernblot的方法检测easpase3活性的变化。(4)APAP诱导小鼠急性肝损伤的信号机制的研

6、究取上述(3)中500mg／kgAPAP剂量下的APNKO及WT小鼠肝脏组织样品，另再取两组同样背景年龄的PBS处理的APNKO及WT小鼠肝脏样品作为对照，采用Westernblot的方法检测ER-stress通路相关标记蛋白P．elF2a、elF2a、BIP、ATF3、CHOP蛋白的变化；同时检测autophagy通路相关标记蛋白ATG7、LC3、p62的变化，同时检测P—AMPK、t-AMPK、Sirtl蛋白的改变，从而揭示其相关的分子信号作用机制。结果：(1)500mg／kgAPAP引发了

7、小鼠的急性肝脏损伤，并下调了机体A1PN的水平与PBS处理的对照组小鼠相比，500mg／kg剂量的APAP作用WT小鼠造成了其血清ALT、AST急剧上升并在24h内达到最高值，其后再缓慢下降，仍高于对照组水平(p

8、均显著下降；同时，APNmRNA表达水平在皮下脂肪及附睾脂肪内也显著降低(p<0．05)。(2)外源重组APN蛋白缓解APAP诱导的小鼠急性肝损伤尾静脉注射APN重组蛋白后lh时，小鼠血清APN循环水平达到了最高值，其后再缓慢下降，6小时后回到基线水平。在APN预处理30min后再给予APAP的小鼠中，其血清APN浓度于2h时达到最高值，之后再缓慢下降，而对照组中PBS预处理的APAP作用小鼠则引起其血清APN水平持续下降，两者相比具有统计学意义(p