外源基因和棉酚对陆地棉茎尖培养和体细胞培养的影响

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1、浙江大学硕士学位论文外源基因和棉酚对陆地棉茎尖培养和体细胞培养的影响姓名：丁亮申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：祝水金2003.5.1摘要本研究以陆地棉(Ghirsutum)的3个品种为材料。系统研究无机盐、激素、碳源、基因型及其外植体等对陆地棉体细胞诱导、胚性愈伤组织的分化、胚状体的形成与植株再生的影响，优化棉花愈伤组织诱导、增殖和胚状体发生和植株再生培养基，以建立棉花体细胞诱导与植株再生技术体系，为棉花体细胞培养研究和棉花转基因研究奠定基础；同时以转基因棉及其遗传背景为材料，研究外源基因对棉花组织培养的影响；以陆地棉色素腺体近等基因系等为材料，研究棉花色，素腺

2、体和棉酚在棉花组织培养中的作用护仁要结果如下：l1．陆地棉组织培养体系的优化：取5日龄无菌苗的外植体，在含有0．1mg／LKT和MSB培养基中连续培养能直接诱导出胚性愈伤组织，也可在含有O．1mg／L的KT和O．05～0．1mg／L的2，4-D的MSB培养基上进行2～3次的继代培养后，转移至含有O．1mg／LKT和29／L活性炭的MSB培养基上诱导胚性愈伤组织。胚性愈伤呈金黄色，米粒状，在水中易分散成较小的颗粒体。胚性愈伤组织的诱导往往与不定根的诱导相关，能诱导出胚性愈伤组织的外植体均有不定根的出生。此外，外植体的类型与胚性愈伤组织的诱导效率也有关系，以子叶为外植体其胚性愈伤

3、分化率高于下胚轴。胚状体再生成植株不需要激素，但活性炭和KN03可以提高正常再生苗频率。再生小棉花经生根培养和壮苗培养后，再采用保湿和逐步炼苗法进行移栽可获得较高的试管苗移栽成活率。2．外源基因对棉花组织培养的影响：取转Bt基因抗虫棉春矮早和遗传背景亲本春矮早进行组织培养，对下胚轴和子叶愈伤组织鲜重进行成对数据比较分析，通过t测试得下胚轴愈伤组织鲜重t=47．667>to叭．P<0．01；子叶愈伤组织鲜重t=-86．711>tool，P<0．叭，表明Bt基因对棉花外植体的愈伤组织诱导有极显著影响。对转Bt基因抗虫棉春矮早与非转基因遗传背景亲本春矮早茎尖生根的成对数据进行比较分

4、析，t测试得茎尖生根t=128．187>t0oI，P<0．01，同样表明了Bt基因对棉花茎尖外植体的生根能力有极T显著影响，外源基因的导入使得转Bt基因陆地棉品种容易进行体细胞培养和茎尖培养。对不同来源转基因品种研究发现，美国转Bt基因棉32B、33B，国产转Bt基因棉国抗22、邯109、CPTI和Bt双价抗虫棉CK321在30d的出愈率均在95％以上，愈伤组织质地与生长势与珂字棉312相似，是易于进行愈伤组织诱导的品种，而对应的遗传背景亲本多为难于培养或较难培养的推广棉花品种。可见，外源抗虫基因的导入可使转基因棉品种容易进行体细胞培养。然而，通过花粉管通道法转化的Bar基因

5、对棉花组织培养无明显影响。3．色素腺体与棉酚在棉花组织培养中的作用：棉花色素腺体和棉酚对棉花茎尖培养不定根的再生具有较强的诱导作用，有色素腺体棉品种的茎尖培养能力优于对应的无色素腺体近等基因系，有色素腺体棉品种比无色素腺体近等基因系再生根平均长0．07cm～0．2lcm，平均叶片数相差O．08～O．76。此外，培养基中IBA的添加能扩大色素腺体近等基因系内的茎尖培养效果的差异。外源棉酚的添加也能促进茎尖培养的效果，在0．1mg／LTBA和0．1～0．2mg／LPF源棉酚相互作用下，对无色素腺体陆地棉茎尖培养的诱导促进作用最为显著，其再生根率分别达到96．2％和95．8％。对于

6、有色素腺体陆地棉茎尖培养来讲，加有0．1mg／LTBA和0．Olmg／L外源棉酚的MSB培养基是茎尖培养的最佳培养基。不同色素腺体近等基因系的根尖培养效果也有差异，但不很有规律。中棉所12t和中棉所16t的根尖培养效果优于对应的有色素腺体近等基因系，而中棉所17z的根尖培养效果却差于对应的有色素腺体近等基因系。棉花色素腺体和棉酚对于棉花体细胞培养的出愈诱导和愈伤组织生长具有显著的抑制作用。在与2，4-D的作用下，外源棉酚达0．2mg／L时大部分来源于子叶的外植体很难形成愈伤组织，添加0．Ol～0．1mg／L外源棉酚下虽不能提高产出量，但可以提高愈伤的质地。棉酚与KT配合使用还

7、能大大促进外植体不定根的诱导率，以0．1～0．2mg／L外源棉酚浓度诱导生根率较高，此外，棉酚诱导离体叶片不定根的再生在细胞遗传学观察上具有重要的意义。r关键词：陆地棉Bt基因Bar基因色素腺体棉酚组织培养∥一‘V‘、∥7o—‘AbstractTheinducingofcallus，formationofembryoandplantregeneration，andsomefactorswhichaffectedthetissueculturesuchasthetypeofmedia，theconcent