新肿瘤相关基因1A6DRIM表达规律的初步研究

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1、北京大学硕士学位论文新肿瘤相关基因1A6/DRIM表达规律的初步研究姓名：武晓楠申请学位级别：硕士专业：细胞生物学指导教师：柯杨;杜晓娟2003.5.1北京大学硕士研究生学位论文中文摘要肿瘤的发生是环境与机体相互作用、多基因参与、多步发展的结果。机体中参与肿瘤发生的众多基因往往也是细胞增殖分化的重要调控基因。深入研究肿瘤相关基因表达规律对阐明细胞生长调控，肿瘤发生的分子机理以及最终攻克肿瘤意义重大。GES．1细胞系是我室以SV-40T抗原转化人胃粘膜上皮细胞获得的永生化细胞系。将GES—l细胞经化学致癌剂MNNG诱导得到MC细胞系。

2、Key．1A6基因是GES．1细胞系和MC细胞系经差异显示方法获得的新的肿瘤相关基因，被GenBank收录(西l1464475，AF072718)。Key-1A6基因与Schwirzke在不转移的乳腺癌细胞系中克隆得到的DRIM基因(gi7657040)的3’端约3000bp完全相同，并且具有相同的开放阅读框架，因此被认作同一个基因，我们将其命名为1A6，DmM。lA6，DmM基因全长约181Kb，eDNA长9017bp，编码2785个氨基酸约310KD的蛋白质。基因定位于人染色体12q23．2．23．3。我室在前期工作中制备了针对

3、1A6／DRIM蛋白C端545个氨基酸的单克隆抗体6D9。免疫荧光和免疫电镜分析显示1A6／DR／M蛋白主要定位于细胞核特别是核仁，在细胞浆中也有少量表达；应用荧光染色体原位杂交技术(FISH)发现该基因在肿瘤组织和肿瘤细胞中没有扩增、缺失和易位。免疫组织化学检测胃癌不同进展阶段的组织样本发现1A6／DRIM蛋白在癌变的早期甚至癌前病变时就有一定比例的表达，并且随着病变进展表达率逐渐增高。前瞻性追踪普查病人的结果也发现1A6／DRIM阳性的肠上皮化生和非典型增生的病人10年后癌变风险比1A6／DRIM阴性的病人显著提高，因此提示1A

4、6／DRIM基因可能在肿瘤发生中起重要作用。为进一步研究此与肿瘤发生相关的基因的功能，我们从1A6／DRIM北京夫学硕士研究生学位论文基因在细胞周期中的表达规律入手开始研究。本实验采用N20—TdR阻断细胞周期同步化和正常培养条件下流式细胞分选两种方法，收集胃癌细胞系BGC一823不同周期时相的细胞，分析1A6／DRIM蛋白在细胞周期不同时相中的表达量的变化和定位情况。Westernblot结果显示1A6／DRIM在G1期细胞核中表达量最高，在S期和G2期核中表达减少。免疫荧光结果显示IA6／DRIM蛋白在细胞中与核仁蛋白Ki-67

5、的表现极为类似。人为控制周期阻断法和自然状态下流式分选法的结果相同。为进一步探讨lA6／DRIM蛋自在BGC．823细胞撤除血清培养的应激条件下的变化规律，我们对BGC．823细胞在无血清条件下培养，结果发现随血清撤除时间的延长，不断有细胞漂浮，这些细胞经DAPI染色为凋亡细胞，凋亡细胞数量随血清撤除时间延长而增多。但仍存在大量贴壁细胞，这些细胞无凋亡现象。选取这部分贴壁BGc．823细胞，在不同的时间点分析】A6／DRIM在细胞核中的表达情况，Westernblot和免疫荧光结果表明1A6／DRIM蛋白在细胞核内的含量随血清撤除时

6、间的延长而增多，在撤除血清第5天重新给予血清后】A6∞删蛋自含量在6—7小时先减少然后逐渐增加，在24小时内恢复正常。同时进行的流式细胞检测提示BGC．823细胞在血清撤除后存在G0／G1期阻滞。以lA6／DRlM基因5’和3’端CDNA片断为探针，通过Northernblot对1A6／DRIM基因的转录改变进行了分析，结果显示1A6／DRIM基因只存在一个9kb左右的转录本，但其在血清撤除和恢复时的改变规律不明显，有待进一步证实。因此1A6／DRIM蛋白在BGC．823细胞的表达不依赖于血清中生长因子的刺激，在撤除血清时在细胞核含

7、量增加，而重新加入血清时含量减少。在对1A6／DRIM蛋白进行Westernblot分析时，除了存在与基因全长相符的310KD的条带外，还常伴随有约160KD，135KD，105KD等比较明显的阳性带型；同时GenBank中1A6／DRIM基因还有两个相当近似的基因序列，它们最主要的差别在于cDNA序列2974、4245、4750北京大学硕士研究生学位论文位点的碱基缺失与否，而这三个位点的碱基缺失可能使后续碱基读框移码产生新的终止密码，从而产生不同大小的蛋白。为检测该基因在不同个体或不同细胞系中是否存在由于这些位点的多态产生的其它蛋

8、白，我们通过PCR和RT-PCR产物测序的方法，对20个细胞系和32例正常人血DNA和6个细胞系的eDNA进行了分析，结果未发现一例在这三个位点有碱基缺失，因此认为2974、4245、4750位点不存在多态性，Westemblot检测