耐氧双歧杆菌的生物学特性研究

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1、贵州大学硕士学位论文耐氧双歧杆菌的生物学特性研究姓名：吴拥军申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：王嘉福20020301耐氧双歧杆菌的生物学特性研究摘要研究了适宜的双歧杆菌分离方法、从婴儿、成人粪便中分离J到36株疑似双歧杆菌，经过属和种的系统生化鉴定，确认为青春双歧杆菌(Bifidobacteri啪adolescentis)、长双歧杆菌(BifidobacteriuInlong啪)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteri啪infantis)和短双歧杆菌(Bifidobacteri啪breve)。采用梯度氧递增法进

2、行耐氧驯化，获得遗传性质稳定的耐氧菌株。通过对其在GAM和PTYG培养基中生长曲线、基质消耗曲线和代谢产物、与肠道菌群的拮抗关系、对肠毒素的降解作用及双歧因子(KGM)的研究，结果表明经过驯化后的耐氧双歧杆菌对单糖发酵试验有明显差异：培养12h菌数分别达8．4×109cfu．m1’1和7．2×109cfu．ml～；pH由7．6降至4．2(培养20h)；对糖和蛋白质的消耗率分别为56．4～56．8％和58．8～60．O％，代谢产物中乙酸：乳酸的克分子数为3：2．08～4．17。耐氧双歧杆菌对产肠毒素大肠杆菌(ETEc)、出血性大肠杆菌

3、(0。：H，)和葡萄球菌等具有较强的抑制作用；对肠毒素(LT+，ST+)有很强的降解力。KGM在37℃发酵72h后，采用薄层层析法分析得到了含有少量单糖及系列低聚葡萄甘露聚糖的双歧因子，对双歧杆菌具有强烈的促生长作用。关键词：耐氧双歧杆菌：分离鉴定：生长代谢：拮抗：降解：双歧因子前言双歧杆菌(Bifidobacterium)于1899年由法国巴斯德研究所的注木本研究为贵州省教委科学研究基金项目Tissier从母乳婴儿粪便中发现，它是定植于人类或某些哺乳动物体内的革兰氏阳性生理细菌，在微生态学上属于原籍菌群【2“。伯杰氏细菌鉴定手册第

4、八版(1974年)首次将其作为正式属名列入放线菌科下，到目前为止已报道的有28种【32】，它们栖居于人和动物(牛、羊、兔、鼠、猪、鸡和蜜蜂等)的肠道；反刍动物的瘤胃；人的牙齿缝穴和阴道以及污水等处。除齿双歧杆菌(B．dentium)可能是病原菌外，其它尚无致病性的报道。双歧杆菌的细胞呈现多样形态：有短杆状较规则或纤细杆状带尖细末端的细胞，有成球形者，也有长而稍弯曲状的或呈多种分枝或分叉形、棍棒状或匙形、单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。G+，不抗酸，不形成芽孢，不运动，严格厌氧，在好氧条件下不能在平皿上生长，某些种有C02

5、存在时能增加对氧的耐受性，最适pH6．5~7．0，分解糖，从葡萄糖产生乙酸和乳酸理论是以3：2mol的比例形成，不产生C02(葡萄糖酸盐降解除外)，不产生丙酸和丁酸，葡萄糖6一磷酸脱氢酶和醛缩酶缺乏或未检出，接触酶阴性(星状双歧杆菌和蜜蜂双歧杆菌例外)，对大多抗生素敏感，DNA的G+c含量范围是55^67Inol％(Bd·Tm)。sgorbati等(1982年)对1461个代表24个种的分离物测定质粒结果表明20％分离物含质粒；不同实验室对双歧杆菌质粒测定结果不一致。微生物对抗生素的抗性是一个遍及全球的严重问题，所以引起世界有关人士

6、的极大观注并专门成立了新抗微生物策略，国际研究组织(简称ISGNAS)已于1993年起进行了一系列活动。其重点是了解消化道中微生物菌群种间以及它们与宿主的相互作用；研究对潜在致病菌的控制和条件致病菌引发疾病的条件；发展可替代的新的治疗方法。在这种情况下，以双歧杆菌为代表的菌株制剂受到了医学界的高度重视。研究表明：双歧杆菌的生理功能有①维持肠道菌群平衡，治疗肠道功能紊乱⋯。双歧杆菌可粘附于肠粘膜上皮细胞，通过自身及产生代谢产物和抑制物排斥致病菌。此夕}它能产生胞外糖苷酶降解粘膜上皮细胞的复杂多糖，而这些糖是潜在致病菌和结合毒素的受体，

7、双歧杆菌代谢作用产生的酸造成肠道内的酸性环境。调节和促进肠蠕动，防止致病菌的定植，维持肠道正常的生理功能。②抗肿瘤作用。双歧杆菌的抗肿瘤作用是由于双歧杆菌的存在及其生成的代谢产物优化了肠道菌群的组合，增强了免疫功能，抑制了肿瘤细胞的增殖和致癌物质的产生。③增强免疫功能。双歧杆菌能激活机体的吞噬细胞的吞噬活性，促进特异性和非特异性IgA抗体的产生，增强了免疫系统的功能。④营养作用。双歧杆菌代谢产生的酸可促进对v．、ca和Fe离子的吸收，它可合成多种维生素。⑤控制内毒素的产生。双歧杆菌可抑制肠道中腐败菌的繁殖从而减少肠道中内毒素和尿素酶

8、的含量，使血液中内毒素和氨含量下降，⑥延缓机体衰老，双歧杆菌能使机体中某些具有抗衰老作用的酶活性升高，使衰老的物质浓度降低。双歧杆菌及其代谢产物对肠道致病菌具有很强的生物拮抗作用。其抑菌作用主要是细胞代谢产生的有机酸使肠道PH值降低，