用DDRTPCR技术分析与巨核细胞分化相关的基因

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1、中国协和医科大学博士学位论文用DDRT-PCR技术分析与巨核细胞分化相关的基因姓名：张曲申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：张俊武2003.6.1中国协和医科大学懦床医学专_泣毕业论文中文摘要K562细胞系是～种人红自盎病缅脆系，它基本处于造血干细魏分化的髓撵褪纲簏阶段瑟婷止继续分化，僵具有双向分化漤能，在氯高铁血红索(Hemin)等试剂的诱导下可以向红系分化，而在肉豆蔻佛波酯(PMA)的诱导下则可以向巨核系分化。这些分化与不间基因的表达或抑制密切籀关。Liang秘Pardee发明鹃差异要示反转录PCR(D

2、DRT-PCR)技术Ⅲ一直被视为筛选新基因的道要方法之一，但它存在假阳性率偏高和重复性较差的缺陷。为解决此问题，我们参照Martin和Pardee的改进方案嘲，建立了一种使鲻长弓

3、物，进行二步PCR的改进DDRT-PCR方法。以氯高铁血红索(Hemin)和肉豆蔻佛波酯(PMA)分别诱导K562细胞36h使之分别向红细胞和巨核细胞分化，取诱导前后的细胞制备总RNA，膺3个3’mRNA锚定弓

4、物及6个5’mRNA随机弓

5、物进行了18霉孛组台PCR扩增，获褥与K562缨施自经系分化耀关的差异cDNA片段60条，其中38条分化届表达

6、上调，22条分化后表达下调；获得与K562细胞向巨核系分化相关的差异cDNA片段120条，熟中46祭分纯看表达上调，74条分化后表达下调。选择43条与巨核缨您分化摆关的差舞带(26条在PMA诱导的K562缨您中表达上调，17条PMA诱导的K562细胞中表达下调)进行PCR再中国协和医科大学临床医学专业毕业论文扩增、纯化回收，以PUCl9质粒为载体对差异EST序列进行克隆、提取重组质粒DNA并测序。然后通过基因信息分析与GenBank数据库[包括GenBank非冗余数据库(nr)、EMBL、DDBJ、PDB、high—thro

7、ughoutgenescreening(htgs)、dbEST、GSS]中的核苷酸序列进行同源性比较。发现20个EST与GenBank中已知蛋白的cDNA高度同源(包括调控因子或信号因子9条，线粒体或核糖体组分2条，假设蛋白3条，血小板特异表达的蛋白1条)，15个与已知EST或cDNA片段有同源性，2个为新EST。这些差异表达EST为进一步获得和确定在巨核细胞分化过程中具有重要作用的全长基因，明确基因的功能及作用机制奠定了一定基础，并对揭示造血细胞分化机制提供了线索。关键词：差异显示反转录PCR，K562细胞，巨核细胞，红系

8、细胞，细胞分化，表达序列标签中莺傍帮医科大学豫床嚣学专鼗孳韭论文AbstractK562celllinewasderivedfromhumanery'throeukemiacells．Itisbasicallyonmyeloidprogenitorstageofhemopoieticstemcelldifferentiationandstoppedcontinuencedifferentiation．However,K562cellshavebipotientalofdifferentiation．Undertheinduc

9、tionofHEM／N，K562canundergoerythropoiesisdifferetiation，whereasundertheinductionofPMA，K562cellcanundergothrombopoiesisdifferentiation．Differentialdisplayreversetranscription-PCR(DDRT-PCR)，inventedbyLiangandPardee，hasbeenwidelyappliedtoscreennovelgenes．However’oneofp

10、roblemsofthismethodisrelativelyhighfalsepos“iverateandlowreproducibility．Toovercomethisproblem，WeimprovedthismethodwithapplyinglongerprimersandrepeatedPCR-basedamplification,referring协MartinandPardee’Smodification．K562cellswererespectivelyinducedintoerythroidandmeg

11、akaryocyticdifferentiationbyHeminandPMAfor36hours。TotalRNAswereextractedfrominducedanduninducedK562cellsandwere5中禽协鞫医科大学鼯床医学专监毕韭论文appliedtomRNAdi