小麦叶锈菌与Lr38互作诱导抗病基因表达DDRTPCR分析

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1、河北农业大学硕士学位论文小麦叶锈菌与Lr38互作诱导抗病基因表达DDRT-PCR分析姓名：闫红飞申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：刘大群;杨文香2003.6.1河北农业大学硕士学位论文摘要小麦叶锈病是～种世界性病害，严重威胁小麦生产。迄今为止，所克隆的抗病基因中关于小麦抗叶锈病基因的成功报道较少。目前世界上还没有对小麦Lr38单基因系具有毒性小麦叶锈菌株，其致病型最高为2。本文应用Lr38和致病型分别为0和2的99—8—9—2—1(O)及99—5—30一2(2)两个叶锈菌菌株为材料，应用差异显示技术，分离叶

2、锈菌与小麦互作反应中诱导表达的mRNA，并将所得mRNA反转录成cDNA。然后进行PCR扩增比较不同处理间出现的差异表达的eDNA片段并对其进行进一步分析，取得了一定的进展。小麦叶锈菌(PucciMareconditaf．sp．tritici)两个菌株99—8—9～2—1(0)及99—5—30—2(2)分别接种含Lr38的单基因系材料，组成强不亲和及弱不亲和互作组合。应用差异显示RT-PCR技术，使用分别带有眦ndⅢ酶切位点的3个锚定引物AAGCT。拼(N为A、G或者c)，与24条10mer随机引物组合，分析以上处理

3、和不接菌对照处理的mRNA表达水平的差异。发现不同引物组合间扩增结果差别较大，且不同引物组合扩增产物问多态性也不同。对接种后12，24，36，48，60和72h的小麦样品分别取样，提取叶片组织总RNA以代替mP&IA进行分析，结果发现在24h即有差异条带出现，但数量很少。在36h出现差异条带明显增多，表现出病原物与寄主植物互作而诱导寄主组织抗病基因的表达。将获得的差异条带回收，并在对应的基本相同条件下扩增以便进行后继工作如Northern杂交检测、cDNA文库构建、克隆、测序等。关键词：小麦i叶锈病；Lr3&mRNA

4、；eDNA：DDRT—PCR独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和ti；lll的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得．躅丝逢生叁嗟或其他教育机构的学位或证书丽使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意．学位论文作者署名：f司弘卺签字日期：d3年s月·，日学位论文版权使用授权书本学位论立作者完全了解Z霉盥亟兰苎沿关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向田家有关部门或机构

5、送交论文的复印件和黻，允许论文被查阅和借Iti．本人授权女重d堑吞建盘孽_可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印威扫描等复制手段#ilil、汇编学li．i仑文．(保密的学位论文在解密后使用本授权书)学位论文作糙名：闭{r1百导师签名：c；川签字日期：6]年S月{分日签字日期：习年学位论文作者毕业去向：工作单位；通讯地址：电话：邮编：竹伽乙朋河北农业大学硕士学位论文文献综述1植物抗病基因分子生物学研究进展植物病害给农业生产造成巨大损失，植物病害合理有效治理是农业可持续发展所面l艋的一项

6、重要问题。这些年来化学农药广泛甚至不合理的应用造成的病原物抗药性问题和环保等问题，以及符合现代社会发展而提出的绿色食品和无公害食品等的需求问题，使化学农药的应用受到越来越多的限制。因此，开发利用植物源抗病资源是解决植物病害闯题的一条行之有效的途径。目前，被育种家们所选用的抵抗植物病害的植物抗病基因皿)是最为重要的一类基因。1992年，玉米抗圆斑病基因Hml【11是被克隆的第一个R基因，迄今至少有30多个R基因被克隆，它们分别介导对植物病原真菌、细菌、病毒和线虫的抗性。新技术的发展和对已克隆R基因认识的深入，促进了R基

7、因克隆新方法的发展和对R基因功能的深入了解。1．1R基因特征根据已克隆的R基因表达产物的结构特征分析发现，绝大多数R基因产物都含有富含亮氨酸的重复序列(Leucine-richrepeatdomain，简称LRR)、核苷酸结合位点(Nucleotidebindingsite，简称NBS)，以及蛋白激酶结构。此外，有的还有亮氨酸拉链结构域或果蝇Toll和人类白细胞介素受体结构域(Toll／Humaninterleukinoreceptorgenecytoplasmicdomain，简称11R)。Takahashi[21

8、最初在人血清中发现一种功能未知的糖蛋白，由于亮氨酸在其中呈有规律的重复出现而将其命名为LRR。后发现这种结构在各种蛋白质中广泛存在，参与蛋白．蛋白的相互作用和信号转导p“J。含有LRR的R基因根据LRR区的细胞定位，将其分为两类：第一类其LRR区位于胞外，在N端信号肽之后；另一类LRR则位于胞内，且常在蛋白质C端，同时具有bIBS。R基因LRR