红花中黄酮类化合物抑制基质金属蛋白酶活性实验研究

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1、长春师范大学本科毕业论文(设计)第一章前言1.1红花简介红花(CarthamustinctoriusL.)为菊科植物,红花属红花的干燥花,生长周期为1~2年,在国际上,印度、美国、埃塞俄比亚、澳大利亚等地为红花主要种植地,在我国则主产于河南、云南、浙江等地,由于其在种植方面有较好的抗旱、耐盐碱、抗寒、用途广泛等诸多优点,在我国栽培种植已经有两千多年的历史[1-3]在历史上,红花被赋予了多种意义,不仅可以用来药用,还可用于食用、染料和油料等。虽然红花成分较为复杂,但已被分离鉴定的化学成分有60多种,主要分为黄酮类、木脂素类、多炔类等几大类,而且存在着200多种色素

2、类成分,其中含有丰富的黄色素和红色素,这是一种纯天然染色剂。其他类型的黄酮类物质,主要有山奈酚(Kaempferol)和槲皮素(Quercertin)为基本母核的一系列衍生物及芦丁(Rutin),杨梅素(Myricetin),芹黄素(Apigenin),木樨草素(Luteoline)等。研究表明红花有效成分主要为红花黄色素,是一组水溶性查尔酮类成分,红花中查尔酮类化合物多为色素类成分,而其中最重要的就是红花黄色素(saffloweryellow,SY)。SY由红花黄色素A(HSYA)和红花黄色素B(SY-B)及其衍生物组成,羟基红花黄色素(Hydroxylsaf

3、floweryellowA,HSYA)的研究是最为广泛的,日本学者龟高德平首先从我国河南承德红花干花中分得红色素(含0.3%~0.6%),它是红花中含量最高的成分[4-7]。红花黄色素有改善心肌及脑组织微循环障碍的作用[8],亦有扩张冠脉,抗氧化,保护心肌,降血压,免疫抑制和脑保护的多种药理学功效[9]。1.2基质金属蛋白酶(MMPs)简介ECM(extracellularmatrixc)是一种存在于细胞间隙中的大分子物质,其临床方面对于研究肿瘤转移有着极其重要的意义,应用蛋白酶降解ECM是治疗多种疾病的有效方法,如强直性脊柱炎,心脑血管疾病,肿瘤,糖尿病,炎症

4、等[10-12]。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)是一类与Ca2+,Zn2+金属离子结合,可对ECM有极强降解作用的超酶家族,据现阶段研究表明MMPs已鉴定出28种,其又可以分为5大类,分别为①胶原酶、②明胶酶、③基质裂解酶、④膜型金属蛋白酶、⑤其它型。这里,胶原酶主要包含MMP-1、MMP-8、MMP-13,明胶酶主要包含MMP-2、MMP-9,基质裂解酶主要包含MMP-3、MMP-10、MMP-11,膜型金属蛋白酶主要包含MMP-14,MMP-15,MMP-16、MMP-17、MMP-24、和MMP-25。酶本身的

5、活性点各不相同,这种不同主要是由于染色体序列不同所导致,由此各蛋白酶对应的底物与抑制剂也各有不同。根据报道,MMPs活性的抑制对肿瘤细胞的行为有重要的影响,而MMP-2的活性也与癌栓及肿瘤大小密切相关[13~15]。本实验研究红花体外抑制基质金属蛋白酶-2活性的作用及抗肿瘤机理,11长春师范大学本科毕业论文(设计)从而为从分子水平上研究红花的治病机理奠定基础,也为进一步从红花中提取基质金属蛋白酶抑制剂提供实验依据。11长春师范大学本科毕业论文(设计)第二章实验部分2.1实验材料、试剂红花药材购买于北京同仁堂大药房(长春汽车厂分店)。羟基红花黄色素A(Hydrox

6、ylsaffloweryellowA,HSYA)标准物质购于中国药品检验所(北京)、红花黄色素B(AnhydrosaffloryellowB,SY-B)标准品为实验室自主分离(纯度达98%)。HEPES(Promega),基质金属蛋白酶-2(MMP-2,Sino-Bilogical),GM-6001(ENZQ),0.05%Brij-35(SANTA),荧光底物DQ(TM)GELTINFROMPIG(Life),无菌水,DMSO等。2.2仪器设备96孔酶标板(鼎国),ThermoScientificVarioskanFlash全波长扫描式多功能读数仪(Beckma

7、n),恒温培养箱(德国)。2.3样品制备自制HEPES缓冲溶液(pH7.0),其成分为50mMHEPES、0.2MNaCl、10mMCaCl2、20µMZnSO4及0.05%Brij-35。精密称取适量广谱MMP的抑制药物GM-6001,用DMSO溶解,配置成15nmol/LGM-6001溶液待用,于-20℃下保存。精密称取适量荧光底物DQ-gelatin,用HEPES缓冲溶液溶解,配置成每50mL缓冲溶液中含有0.2mg的DQ-gelatin溶液待用,于-20℃下保存。称取100g红花药材粉末(过40目筛),75%乙醇室温下浸泡提取6次,每次提取12小时,将7

8、5%乙醇提取液过滤合并,

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