柞蚕Antheraeapernyi部分品种的RAPD分析

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1、沈阳农业大学硕士学位论文柞蚕（Antheraeapernyi）部分品种的RAPD分析姓名：宋宪军申请学位级别：硕士专业：特种经济动物饲养指导教师：秦利;秦启联2003.6.1摘要本文以柞蚕蛹、卵为材料，采用RAPD标记技术，对柞蚕生产上的部分品种及杂交种进行了遗传差异研究。结果如下：一、柞蚕蛹模板DNA的提取，以蛹为材料，对几种提取方法进行了比较研究，并对其中一种方法的关键技术加以改进，结果表明：采用改进的方法提取DNA，可以省去蛋白酶K和RNA酶自q消化步骤，以此DNA为模板进行PCR，对RAPD分析的结果没有

2、影aI自文以柞蚕卵为材料提取模板DNA，因提取方法不同，对RAPD分析结果影响较大。除去卵壳后再提取的DNA，以此作模板进行PCR的扩增结果和重复性较好；不除去卵袁直接提取的模板DNA作模板，可能因一些因素的影响，PCR的产物较少。∥二、本论文对PCR的反应条件进行了优化，探索出了产物量和重复性较好的反应程序；对不同厂家的琼脂糖和不同浓度的凝胶也进行了比较，发现不同产地琼脂糖和不同浓度的凝胶对检测效果影响很大，选择一种在成像仪下效果较好的琼脂糖和最优浓度的凝胶，优化后的反应程序为：94℃预变性60s，然后以94℃

3、变性30s，40℃退火60s，72℃延伸90s，进行40个循环，最后72℃下延伸10min。1．4％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在EAGLEEYEⅢII凝胶影像仪观察并拍照。三、采用Tree．conw．1．3版本软件对柞蚕蛹DNA的RAPD分析结果进行了聚类分析，结果表明：供试的柞蚕品种没有按体色系统聚集在一起，而是按品种来源的不同而聚集在了一起，来自山东省烟台市方山蚕种场保育的5个品种一胶蓝、烟6、青黄、方山黄1号、789聚在了一起，表明它们之间的亲缘关系较近：来自沈阳农业大学保育的品种～青6号、选大l号、黄蚕

4、聚在了一起，说明青6号和选大1号这两个青黄蚕系统的品种亲缘关系较近。四、应用RAPD的标记技术对柞蚕品种及杂交种卵DNA进行了RAPD分析，结果表明，个别引物是有效的并有可重复性，可以用做品种纯度鉴定。～心本试验对部分生产用柞蚕品种进行了研究，特别是首次对柞蚕卵的原种及其杂交组合的FI代进行工研究，建立了一套可行的研究方法，为今后从事这方面的研究奠定基础。／关键词：RAPD标记：柞蚕；品种中国柞蚕(Antheraeapernyi)属天蚕蛾科(Saturniidae)柞蚕属(Antheraea)柞蚕种的泌丝昆虫，是

5、我国特有的一种生物资源，是具有重要经济价值的昆虫，主要分布于中国，朝鲜、日本、印度、俄罗斯等国也有少量分布。饲料为栎属(Quercus)植物中的辽东栎(Q“口D，“甥Pns括)、麻栎(Qacutissima)、蒙古栎@mongolica)等。我国柞蚕茧的产量每年约5万吨，占世界总产量的80％左右。目前，我国约有100多个柞蚕品种和遗传资源，这是柞蚕遗传育种的宝贵资源，也是发展柞蚕生产的基础。柞蚕品种资源的研究是柞蚕新品种选育的基础和前提，对于发展柞蚕生产具有极其重要的意义。对柞蚕的种质资源现已从形态学、生态学等方

6、面进行了比较系统的研究。但是，由于种质资源研究的技术和手段落后，影响着柞蚕种质资源的有效利用。关于柞蚕品种的分类学研究，主要从两个方面进行，一是依据产地将各品种分成不同的类群，如山东的客岭庄、河南的鲁山种、贵州的湄潭种等，这种分类方法在品种交流较少时比较可行。现在各地的保存及使用的品种主要是20世纪60年代以后选育的品种，这些品种分类方面的研究还很缺乏，目前主要是利用柞蚕一些重要的表型特征(如化性)或直观附外部形态特征(如体色)等为依据进行分类。这种分类方法难以准确地说明柞蚕各品种之间的亲缘关系，不能很好地指导育

7、种实践。另外，柞蚕的驯化时间和传播时问较短，品种之间的亲缘关系可能更近，利用形态特征标记所能提供的信息量非常有限。所以，需要使用新的更为灵敏的遗传标记进行研究，以提供更多的遗传信息。现行的柞蚕品种依据幼虫5龄期的体色进行分类，可将其划分成4个系统：即青黄蚕系统、黄蚕系统、蓝蚕系统、自蚕系统(沈阳农业大学，1979；辽宁蚕业研究所，1994)。杨效文等(1999)研究表明，同一体色的蚜虫之’鲨里壅些奎堂堡主兰垡笙苎间存在地理分化；刘治国等(1999)的研究认为，控制柞蚕体色的基因数目较少，因此，利用柞蚕幼虫的体色对

8、其进行的分类可能并难以真实反映出品种间的遗传关系。柞蚕的化性存在异地变性的现象，难以作为品种分类的依据。Reineke等(1999)对舞毒蛾地理种群的研究也表明，舞毒蛾地理种群有地理分布的集中性。而柞蚕分布区的生态地理环境差异极大，因此，我们推测柞蚕品种按其地理分布进行品种分类可能更合适。一、柞蚕种质资源的研究现状(一)柞蚕的地理分布按柞蚕业的生产历史、地域气候等可将我国