生物人工肾单位的构建与体外功能评估

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1、中国人民解放军军医进修学院;中国人民解放军总医院博士学位论文生物人工肾单位的构建与体外功能评估姓名：黄大伟申请学位级别：博士专业：内科学（肾病）指导教师：陈香美20080605军医进修学院博士论文管装置，因而结构较复杂；②生物人工肾小管不具备抗凝功能，需持续给予肝素进行抗凝；⑦生物人工肾小球无重吸收功能，不能对超滤液中的营养物质进行重吸收，因而影响患者的预后．针对目前BAK系统的缺陷，我们考虑采用如下方法进行改进：把生物人工肾小球与生物人工肾小管进行“组合"，以利于生物人工肾系统功能的复合化．在本研究的实验研究二中，我们把．血管内皮细胞ECV304与肾小管上皮细胞HKC等比例混合后种植在层黏

2、连蛋白包被的AV400滤器中，让构建的生物人工滤器同时兼备生物人工肾小球与生物人工肾小管的功能，形成一个类似生理意义上的“肾单位竹，可称之为“生物人工肾单位"．方法：1．制备合有A．Nanog基因的复制缺陷型重组腺相关病毒血清2型病毒颗粒rAAV2．hNanog，if]rAAV2-hNanog转染血管内皮细胞ECV304与肾小管上皮细胞HKC，光镜下观察两种细胞转染后细胞形态的状况、同时应用M耵检测转染后细胞增殖的情况；转染hNanog基因48小时后，用BrdIJ(S期细胞的标志物)间接免疫荧光和流式细胞仪分别检测ECV304与HKC两种细胞处在DNAo,合成期的细胞数目、处于S期细胞的百分

3、比；经G418筛选获得表达hNanog基因的ECV304—心孤09细胞与表达bN觚og基因的Ⅷ(G_hNanog细胞、鉴,,定．hNanog基因在ECV304---hNanog细胞以及HKG-hNanog细胞中的表达；2．以层粘连蛋白包被的Av400滤器(Fres％iu讼司0．7m2)为载体，分别检溺,]ECV304细胞、HKC细胞、ECV304与HKC两者的等比例混合细胞、ECV304--hNanog细胞、HKC--hNanog细胞、ECV304--hNanog与HKc--hNanog两者的等比例混合细胞对聚砜膜中空纤维材料的黏附状况；3．在明确ECV304一_hNanog细胞与HKD_b

4、Nanog细胞对聚砜膜中空纤维材料黏附状况的基础上，通过EcV30“lN姐09与HKG山N锄og等比例混合种植的方法构建混合细胞生物人工肾单位，并设立对照组及空白对照组，用Hoechst染色、PKH26／PKH67染色检测两种转染细胞混合种植后在聚砜膜中空纤维上的密度及各自的分布情况，用扫描电镜观察种植细胞的生长状态；4．采用EcV304_-hN勰og与HKCI—IlNanog等比例混合种植的方法构建混合细胞生物人工肾单位，设立对照组及空白对照组，在体外对构建的生物人工肾单位进行内分泌功能与重吸收功能的测定，并对其重吸收功能的特性进行研究．2军医进修学院博士论文结果：1．rAAV2．hNan

5、og转染肾脏组织工程种子细胞后，RT．PCRj佥测表明hN趾og基因能在ECV304--4tNanogfi日胞及HKC-曲N纽og细胞中稳定表达；2．ECV304及HKC细胞在转染后的增殖能力显著增强(尸

6、细胞及HKG—lNanog细胞可在中空纤维的表面混合生长，并形成单层；7．转染细胞混合组(EcV304--hN孤09与Ⅷ

7、P<0．01)，但低于转染HKC组(P<0．01)。结论：1．hNanog基因能提高血管内皮细胞ECV304与肾小管上皮细胞HKC的增殖能力，进而增加单位时间内血管内皮细胞与肾小管上皮细胞的产量，此为生物人工肾的快速构建及应用提供了一种新方法；2．采用转染的血管内皮细胞与转染的肾小管上皮细胞混合种植所构建的生物人工滤器，具备生物人工肾小球与生物人工肾小管的功能，可作为一个“生物人工肾单位”，此为生物人工肾系统