生物人工肾小管体外构建、功能优化、治疗mods%2fmof并arf实验的研究

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1、!!兰堕塞垦壁查主堡尘兰竺坠兰英中文对照及部分缩略词ad5E1AHumanadenovirus5ear]YARFCKCLPCRRTCVVHEDTAELISAESRDHEHpFACSIL一1OLMMAPMODSMOFMTTregioFi1AacLIterenalfailurecYtokinececal1igatiOilandpuncturecontinilousrenalrep!acemeilttherapyC0rltinl.10usvenovenouShemofiItrationethylel3ediarniilotet

2、ra.acetjcacidellzyme一1inkedimmunosorbantasSayendstagerenaldiseasehematoxylinande0SirlhighpowerobjectiveF1t10rescenceActivatedCeIIS0rterinterleukin—lO1ightnliCroscopemeanarteriaIpressuremultipleorgandysfunctiOnsyndromemultipleorganfailuremethylthiazoly!tetraz01.uI

3、Yl-2.人类腺病毒早期区域1A急性肾衰竭细胞因子盲肠结扎加穿孔连续性’肾替代治疗连续性静脉静脉血液滤过乙二胺四乙酸酶联免疫吸附试验终末期’肾病苏木精和伊红高倍显微镜荧光激活细胞分选器白细胞介素一10光动脉压官功能障碍彳正官衰竭蓝(甲基噻唑唑)镜均器合器唑四平多综多噻基卜文南京医科人学博卜、≯化论文PBSRADSCrTNF一ⅡULPhosphatebufferedsaJinebioartifiCialFenaltubUleassistdeviCeserumCreatjninetumornecrosisfaCtor一0【u

4、reteral1igatioil.3.磷酸盐缓冲液生物人工肾小管辅助装置血清肌酐肿瘤坏死因子一C【输尿管结扎术中文摘要生物人工肾小管的体外构建、功能优化、治疗MOIDS/MOF并ARF的实验研究博士生导师应旭曼王笑云研究目的探讨生物人工’肾小管的体外构建方法,对急性肾衰竭合并多脏器功能障碍综合征/多器官衰竭(ARF并MODS/MOF)的治疗作用以及通过基因工程的方法使其功能进一步优化(肾小管上皮细胞永生化),旨在体外能生物性模拟肾小管功能,完善目前肾替代治疗只能替代肾小球滤过功能之不足,提高肾替代治疗的存活率。方法猪肾近

5、曲小管上皮细胞株(LLC—PKl)体外培养后植入血液滤过器(FH66)中空纤维内腔继续培养。期间以MTS方法测定滤器内细胞活性。二周后在体外模拟液体滤过,测定钠离子(Na’)、钾离子(K+)、钙离子(Ca2+)、肌酐(Cr)、葡萄糖(G1u)及氨基酸重吸收功能的变化。并观察哇巴因、根皮苷对Na+、GlU、氨基酸重吸收的影响。应用盲肠结扎和穿孔(CLP)合并双侧输尿管结扎术(uL)制作MODS并ARF猪模型。随机分为RAD治疗组(A组)、假RAD治疗组(B组)、CVVH治疗组(C组)和未治疗组(D组)。观察生命体征、肝肾功

6、能、细胞因子IL一10、TNF—ft.和生存时间。在上述实验基础上,进一步构建永生化人肾近曲下史小管上皮细胞株以优化RAD功能。人胚肾细胞株(293细胞)培养后,用RT.PCR方法扩增出ad5E1A基因。KPnI和EhOI双酶切后与PShuttleCMV载体连接并测序。联合应用LiPOfectamine转染原代培养的人。肾近曲小管上皮细胞,筛选出阳性克隆,RT—PCR鉴定目的基因的表达,免疫荧光测定蛋白表达。并用MTT及流式细胞仪测定其生长特性。通过AKP、LDH、NAG及钠钾ATP酶的检测明确转化后细胞的功能并与HK2

7、细胞株作比较。结果采用上述方法构建的RAD体外实验中肌酐重吸收率较对照组明显降低(P<0.01);初始RAD组与对照纽的Na+、葡萄糖、氨基酸的重吸收率无明显差异(P>0.05)。液体中加入哇巴因及根皮苷后,Na+、葡萄糖、氨基酸的重吸收率明显降低且与对照组相比有明显差异(P<0.01)。祛除药物抑制因素后,重吸收率又能恢复,与阴性对照组差异不明显(P>0.05)。利用RAD治疗MODS/ARF动物的实验中,四组动物治疗前平均动脉压(MAP)无显著性差异。RAD组(A组)治疗后血压逐渐回升,MAP显著高于同时间点的假RA

8、D组(B组)、常规CvvH组(C组)和非治疗组(D组)(P<0.01);四组动物治疗前血肌酐(SCr)无显著差异;治疗24hA、C组SCr水平明显低于B、D组(P<0.05),A、c组之间则无显著性差异。A组治疗后1L一10的峰值显著高于其余三组(P<0.01)。A组治疗开始24小时后血TNF—C【水平较治疗前显著降

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3、Yl-2.人类腺病毒早期区域1A急性肾衰竭细胞因子盲肠结扎加穿孔连续性’肾替代治疗连续性静脉静脉血液滤过乙二胺四乙酸酶联免疫吸附试验终末期’肾病苏木精和伊红高倍显微镜荧光激活细胞分选器白细胞介素一10光动脉压官功能障碍彳正官衰竭蓝(甲基噻唑唑)镜均器合器唑四平多综多噻基卜文南京医科人学博卜、≯化论文PBSRADSCrTNF一ⅡULPhosphatebufferedsaJinebioartifiCialFenaltubUleassistdeviCeserumCreatjninetumornecrosisfaCtor一0【u

4、reteral1igatioil.3.磷酸盐缓冲液生物人工肾小管辅助装置血清肌酐肿瘤坏死因子一C【输尿管结扎术中文摘要生物人工肾小管的体外构建、功能优化、治疗MOIDS/MOF并ARF的实验研究博士生导师应旭曼王笑云研究目的探讨生物人工’肾小管的体外构建方法,对急性肾衰竭合并多脏器功能障碍综合征/多器官衰竭(ARF并MODS/MOF)的治疗作用以及通过基因工程的方法使其功能进一步优化(肾小管上皮细胞永生化),旨在体外能生物性模拟肾小管功能,完善目前肾替代治疗只能替代肾小球滤过功能之不足,提高肾替代治疗的存活率。方法猪肾近

5、曲小管上皮细胞株(LLC—PKl)体外培养后植入血液滤过器(FH66)中空纤维内腔继续培养。期间以MTS方法测定滤器内细胞活性。二周后在体外模拟液体滤过,测定钠离子(Na’)、钾离子(K+)、钙离子(Ca2+)、肌酐(Cr)、葡萄糖(G1u)及氨基酸重吸收功能的变化。并观察哇巴因、根皮苷对Na+、GlU、氨基酸重吸收的影响。应用盲肠结扎和穿孔(CLP)合并双侧输尿管结扎术(uL)制作MODS并ARF猪模型。随机分为RAD治疗组(A组)、假RAD治疗组(B组)、CVVH治疗组(C组)和未治疗组(D组)。观察生命体征、肝肾功

6、能、细胞因子IL一10、TNF—ft.和生存时间。在上述实验基础上,进一步构建永生化人肾近曲下史小管上皮细胞株以优化RAD功能。人胚肾细胞株(293细胞)培养后,用RT.PCR方法扩增出ad5E1A基因。KPnI和EhOI双酶切后与PShuttleCMV载体连接并测序。联合应用LiPOfectamine转染原代培养的人。肾近曲小管上皮细胞,筛选出阳性克隆,RT—PCR鉴定目的基因的表达,免疫荧光测定蛋白表达。并用MTT及流式细胞仪测定其生长特性。通过AKP、LDH、NAG及钠钾ATP酶的检测明确转化后细胞的功能并与HK2

7、细胞株作比较。结果采用上述方法构建的RAD体外实验中肌酐重吸收率较对照组明显降低(P<0.01);初始RAD组与对照纽的Na+、葡萄糖、氨基酸的重吸收率无明显差异(P>0.05)。液体中加入哇巴因及根皮苷后,Na+、葡萄糖、氨基酸的重吸收率明显降低且与对照组相比有明显差异(P<0.01)。祛除药物抑制因素后,重吸收率又能恢复,与阴性对照组差异不明显(P>0.05)。利用RAD治疗MODS/ARF动物的实验中,四组动物治疗前平均动脉压(MAP)无显著性差异。RAD组(A组)治疗后血压逐渐回升,MAP显著高于同时间点的假RA

8、D组(B组)、常规CvvH组(C组)和非治疗组(D组)(P<0.01);四组动物治疗前血肌酐(SCr)无显著差异;治疗24hA、C组SCr水平明显低于B、D组(P<0.05),A、c组之间则无显著性差异。A组治疗后1L一10的峰值显著高于其余三组(P<0.01)。A组治疗开始24小时后血TNF—C【水平较治疗前显著降

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