嗜热真菌热稳定纤维素酶的分子改造

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1、山东农业大学博士学位论文嗜热真菌热稳定纤维素酶的分子改造姓名：张亚波申请学位级别：博士专业：环境生物学指导教师：李多川20090607嗜热真菌热稳定纤维素酶的分子改造个氨基酸均属于保守性的氨基酸。通过硫酸铵沉淀、DEAE—SepharoseFastFlow阴离子层析、Phenyl．Sepharose疏水层析等步骤纯化了该蛋白，酶学性质与野生酶进行了比较，并初步探讨酶活力提高的可能机制。利用融合PCR技术在egl的5’末端连接了来自于嗜热毛壳菌(C．thermophilumCT2)的cbhl基因，经测序验证读码框正确后，构建表达载体转化毕赤酵母GSll5中，筛选到一株表

2、达量较高的融合基因eglcbhl的酵母工程菌株，命名为GPNl3。该菌株表达的融合酶的分子量为88kDa，最适温度和pH分别为50"c和4．0，对不同底物的酶活力均高于内切葡聚糖酶egl的活力。大多数纤维素水解酶至少由催化区和结合区组成，催化区含有催化水解纤维素B．1,4糖昔键的活性位点；纤维素吸附区(CBD)，主要功能是结合纤维素，对纤维素的超分子结构具有特异性，能够提高酶对纤维素的吸附，从而增加纤维素底物的水解。CBD在纤维素酶对不溶性纤维素底物的水解中起着关键作用，关于CBD作用的多数信息，是通过去除该结构域、改变结构域或进行定点诱变研究而得到，本实验室已经从嗜

3、热毛壳菌中分离到了cbhl和cbh3基因，cbhl具有完整的结构即：催化区、结合区以及连接两个区域的连接桥；而cbh3缺少结合区，本研究在无结合区的嗜热毛壳菌cbh3酶蛋白的C端通过融合PCR技术连接了cbhl基因的纤维素结合区CBD，经测序验证读码框正确后，构建表达载体转化毕赤酵母中，筛选到一株高表达量的融合基因cbh3．J的酵母工程菌株，命名为GPBl03。该菌株表达的融合酶蛋白分子量为51kDa，最适温度和pH分别为60。C和4．0，滤纸酶活较cbh3提高了1．2倍，DEAE．SepharoseFastFlow阴离子层析纯化了该蛋白，并对酶学性质进行了研究。关键

4、词：嗜热毛壳菌，嗜热子囊菌光孢变种，热稳定纤维素酶，基因融合，分子改造，表达2山东农业大学博士学位论文AbstractCelluloseisthemostabundantorganiccompoundonEarth，widelyspreadingasoneofthecheapestrenewalresources，butmostofitcan’tbeuseddirectlyandbecomescellulosewaste．Almostallofthecellulosewaste，suchascropresidual，usedpaper，forestwasteandSO

5、on，ismerelyburnedordesertedwithouttreatmentinChina,whichcausesmanyenvironmental，ecologicalproblemsandseveralbillionyuaneconomiclossesinoneyear．Thecellulosewasteisdifficulttobeusedbecauseitisatoughmoleculetobreakdown，butitCanbeconvertedintosugars，whichcanbeeasilyusedinindustry,bycellulas

6、es．CellulasesCanalsousedintextileindustry,paperandpulpindustry,foodindustry,feedindustry,detergentindustryandSOon．Thecellulasereferstoaclassofenzymesproducedchieflybyfungi，bacteria,andprotozoansthatcatalyzesthehydrolysisofcellulosebyHydrolyzing1,4-beta-D-glycosidiclinkagesincellulose．Al

7、thoughthecellulasehasbeenwidelyusedasallimportantindustrialenzyme，itshouldbeimprovedinenzymeactivity,thermostability,pHstabilitytomeettheindustryneed．Thermophilesaremainsourcesofcellulaseswithhighthermostability．Cellulasesfromthethermophilicfungihavebeenreportedtobestableandhig