产脂肪酶微生物的筛选及其在多糖水解中的应用

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1、SCREENINGoFLIP!．ASE．PRODUCINGMICRooRGANISMSANDTHEAPPLICATIoNOFLIPASEINHYDROLYSIS0FPOLYSACCHARIDESubmittedtoZhejiangUniversityofTechnologyforMasterDegreeWrittenbyShangLimingMajoringinMicrobiologySupervisedbyProfessorChenXiaolongCollegeofBiologicalandEnvironmentalEngineering

2、ofZhejiangUniversityofTechnologyApril，2013浙江工业大学学位论文原创性声明lUllIIIIIIIIIIIIIIII111[11111MIIII』Y2411440本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，，也不含为获得浙江工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。作者虢南j：!l呗

3、日期．邶年多月3日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密口，在年解密后适用本授权书。2、不保密瓯(请在以上相应方框内打“√”)作者签名：佝习·咽剥醛轹佻山产日期：卫7；年6月岁日日期：二·眵年6月弓日浙江工业大学硕士学位论文产脂肪酶微生物的筛选及其在多糖水解中的应用摘要

4、脂肪酶旧C3．J『．J『．3)即三酰甘油酰基水解酶，是一种酯键水解酶，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸。目前己发现多种具有不同酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中已表现出良好的应用前景。脂肪酶具有来源广泛，分离纯化简单和成本低廉等诸多优点，将其作为非专一性水解酶应用于几丁质的水解，将极大的降低酶法制备几丁寡糖的成本。本文通过富集培养、初筛培养和复筛培养从土壤中获得6个具有明显脂肪酶活性的菌株，对酶活最高的一株进行26srDNAITS区扩增并测序，通过与NCBI中保存的

5、数据进行相似性分析来进行菌种鉴定，同时构建菌株的进化树。经鉴定此菌株属于Rhizopus属中的Stolonifer种，中文名称为匍枝根霉。为获得最高的脂肪酶产量，在摇瓶培养条件下，利用响应面法，对匍枝根霉发酵的培养基配方和培养条件进行优化。优化后，可溶性淀粉7．60g／L，酵母膏22．59g／L，K2HP045．55g／L，NH4C11．80gm，MgS04’7H202．40g／L，NaCl1．00g／L，橄榄油25．oomL／L，吐温．808．00mL／L，pH4．59，此时酶活达到最高，为1．40U／mL，与发酵优化前(0．46U／mL

6、)相比，酶活提高了204．35％。浙江工业大学硕士学位论文发酵液经过离心、60％硫酸铵沉淀、透析、粗酶液浓缩、正己烷萃取、DEAE．Sepharose阴离子交换后，经SDS．PAGE电泳检测纯化后脂肪酶达到电泳纯，回收率为21．5％，纯化倍数为32，分子量约为35KD，酶活为5760U／g。以PNPP为底物，酶促反应的Km和Vm觚分别为0．77mmol／L和5．39gmol／L·min。将猪胰脂肪酶、假丝酵母脂肪酶、NOVO435脂肪酶、扩展青霉脂肪酶和纯化后脂肪酶同时应用于几丁质的水解，结果发现猪胰脂肪酶水解效果最明显，对其水解几丁质的条

7、件进行研究，通过考察酶量、底物浓度、温度、pH和反应时间等因素对猪胰脂肪酶水解几丁质的影响，确定反应条件为：反应体系2mL，猪胰脂肪酶0．01g，胶体几丁质浓度5％，pH7．0，反应温度60。C。反应30h后，几丁质的水解率为6％。关键词：脂肪酶，筛选，响应面，纯化，多糖浙江工业大学硕士学位论文SCREENINGoFLIPASE．PRoDUCINGMICRooRGANISMSANDAPPLICATIONOFLIPASEINTHEHYDRoLYSIS0FPoLYSACCHARIDEABSTRACTLipase(EC3．j．J．3)isanes

8、terhydrolase，whichcatalyzestriglyceridetoformdiacylglycerol，glycerolester，glycerolandflee