阿尔茨海默病模型大鼠Tau蛋白异常磷酸化表达及补肾化痰法的干预作用

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1、阿尔茨海默病模型大鼠Tau蛋白异常磷酸化表达及补肾化痰法的干预作用作者：胡慧，王平，孔明望，丁凤敏【摘要】目的探讨补肾化痰法对AD模型大鼠Tau蛋白异常磷酸化的影响。方法应用脑立体定向技术给大鼠Meynent基底核注射凝聚态Aβ25-35+IBO构建AD模型。注射2周后，高、中、低量组分别给大鼠该药水煎液灌胃;西药组用哈伯因混悬液灌胃;正常组、空白组、模型组均给予等容积的生理盐水灌胃。28d后采用蛋白免疫印迹法检测海马匀浆中Tau蛋白磷酸化总量。结果正常组与空白组海马区Tau蛋白磷酸化水平无明显差异(P>0.05)，模型组海马区Tau蛋白磷酸化

2、水平显著增加(P<0.01)，给药后发现不但大鼠海马组织Tau蛋白异常磷酸化水平下降，高、中量组与模型组比较显著降低(P<0.01)，与西药组也有差异(P<0.01)。结论补肾化痰法可以降低Tau蛋白异常磷酸化水平，从而发挥其抗老年性痴呆的作用。【关键词】阿尔茨海默病;Tau蛋白;补肾化痰法　阿尔茨海默病(Alzheimer's11disease,AD)是一种以进行性记忆障碍和智能衰退为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病，随着人口老龄化的日趋严重，AD已经成为危害老年人健康的主要疾病之一[1]。AD患者的特征性病理改变包括神经原纤

3、维缠结(Neurofibrillarytangle,NFT)、老年斑(Senileplaques,SP)和颗粒空泡变性。NFT在神经元胞体内，由高度磷酸化的Tau蛋白聚集形成，其数目和AD的痴呆程度密切相关，因此有人认为Tau蛋白的过度磷酸化是AD的核心病变[2]。本实验观察了补肾化痰法对AD模型大鼠Tau蛋白异常磷酸化的影响，以探讨补肾化痰法对AD神经保护作用机制。　　1材料与仪器　　1.1药物补肾化痰方由制首乌、石菖蒲、竹节参、茯苓、陈皮、半夏、白芥子等组成,购自湖北中医学院国医堂门诊部。中药经水煎制成浓缩液。哈伯因,河南众生制药股份有限公司豫中

4、制药厂产品，批号:060321。　　1.2试剂Aβ25-35和IBO购于Sigma公司，免疫印迹化学发光试剂(ECL)、BCA蛋白浓度检测试剂盒、预染的蛋白Marker、PVDF膜、蛋白提取试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。兔抗大鼠磷酸化Tau抗体(PHF-1)购自abcam公司，HRP标记的羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。　　1.3仪器电泳仪(DYY-4C)、垂直电泳槽、电转移槽、凝胶成像扫描仪均为北京六一仪器厂生产。11　　2方法　　2.1动物及分组15月龄Wistar大鼠70只，雌雄各半，体质量(450±50)g，随机分为7组，每

5、组10只。由湖北省实验动物研究中心提供。实验分组：①Aβ25-35+IBO模型组(简称模型组);②假手术组(简称空白组);③正常组;④哈伯因治疗组(简称西药组);⑤补肾化痰法高剂量组(简称高量组);⑥补肾化痰法中剂量组(简称中量组);⑦补肾化痰法低剂量组(简称低量组)。　　2.2AD模型构建模型组大鼠用2%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上，颅顶正中切开暴露至颅骨，根据大鼠颅脑立体定位图谱，对基底核立体定位(位置:前囟后3.8mm，中线旁开2.5mm，深度3mm)，用牙科钻钻开颅骨，用1μl微型进样器注射针5min内缓慢

6、注入Aβ25-35+IBO混合液1μl，予以留针10min。注射完毕后以局部软组织封闭针孔，缝合皮肤。术后给予青霉素钠盐5万u肌注，1次/d，连续3d。空白组在定位下给予大鼠meynert基底核一次性注射1μl灭菌生理盐水。　　2.3给药脑内注射2周后给药。给药量均按人与大鼠体表面积系数比确定，以临床人用药等效剂量做为中剂量，模型组、空白组、正常组给予生理盐水灌胃，1ml·(100g)-1·d-1，连续28d。西药组给予哈伯因混悬液灌胃，1ml·(100g)-1·d-1，连续2811d。高量组、中量组、低量组分别给予补肾化痰方水煎液灌胃，含生药分别是

7、2g·ml-1，1g·ml-1，0.5g·ml-1，1ml·(100g)-1·d-1，连续28d。　　2.4取材动物水迷宫后断头，冰台上迅速取脑，分离海马组织一部分放入液氮速冻。　　2.5Westernblot检测大鼠海马组织Tau蛋白异常磷酸化　　2.5.1组织中总蛋白的提取①从液氮中取50mg海马组织块，尽量剪碎组织块;②放入匀浆器中，加入400μl缓冲液(含PMSF)，然后置于冰上进行匀浆;③4℃下12000r/min离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。　　2.5.2蛋白含量的测定①取1.5ml离心管，每管加入4℃储

8、存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后用于测蛋白。②取一管考马斯亮蓝加0.15mol/LNaCl溶液