阿尔茨海默病模型大鼠tau 蛋白异常磷酸化表达及补肾化痰法的干预作用论文

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1、阿尔茨海默病模型大鼠Tau蛋白异常磷酸化表达及补肾化痰法的干预作用论文胡慧，王平，孔明望，丁凤敏【摘要】目的探讨补肾化痰法对AD模型大鼠Tau蛋白异常磷酸化的影响。方法应用脑立体定向技术给大鼠Meynent基底核注射凝聚态Aβ25-35+IBO构建AD模型。注射2周后，高、中、低量组分别给大鼠该药水煎液灌胃;西药组用哈伯因混悬液灌胃;正常组、空白组、模型组均给予等容积的生理盐水灌胃。28d后采用蛋白免疫印迹法检测海马匀浆中Tau蛋白磷酸化总量。结果正常组与空白组海马区Tau蛋白磷酸化水平无明显差异(P0.05)，模型组海马区Tau蛋白磷酸化水平显著增加(P0.01)，给药后发

2、现不但大鼠海马组织Tau蛋白异常磷酸化水平下降，高、中量组与模型组比较显著降低(P0.01).freeler'sdisease,AD)是一种以进行性记忆障碍和智能衰退为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病，随着人口老龄化的日趋严重，AD已经成为危害老年人健康的主要疾病之一1。AD患者的特征性病理改变包括神经原纤维缠结(Neurofibrillarytangle,NFT)、老年斑(Senileplaques,SP)和颗粒空泡变性。NFT在神经元胞体内，由高度磷酸化的Tau蛋白聚集形成，其数目和AD的痴呆程度密切相关，因此有人认为Tau蛋白的过度磷酸化是AD的核心病变2。本实验观

3、察了补肾化痰法对AD模型大鼠Tau蛋白异常磷酸化的影响，以探讨补肾化痰法对AD神经保护作用机制。1材料与仪器1.1药物补肾化痰方由制首乌、石菖蒲、竹节参、茯苓、陈皮、半夏、白芥子等组成,购自湖北中医学院国医堂门诊部。中药经水煎制成浓缩液。哈伯因,河南众生制药股份有限公司豫中制药厂产品，批号:060321。1.2试剂Aβ25-35和IBO购于Sigma公司，免疫印迹化学发光试剂(ECL)、BCA蛋白浓度检测试剂盒、预染的蛋白Marker、PVDF膜、蛋白提取试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。兔抗大鼠磷酸化Tau抗体(PHF-1)购自abcam公司，HRP标记的羊抗兔二抗购自

4、武汉博士德生物工程有限公司。1.3仪器电泳仪(DYY-4C)、垂直电泳槽、电转移槽、凝胶成像扫描仪均为北京六一仪器厂生产。2方法2.1动物及分组15月龄SF)，然后置于冰上进行匀浆;③4℃下12000r/min离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。2.5.2蛋白含量的测定①取1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后用于测蛋白。②取一管考马斯亮蓝加0.15mol/LNaCl溶液100μl，混匀放置2min做检测空白样品。③取一管考马斯亮蓝加95μl0.15mol/LNaCl溶液和5μl待测蛋白样品，混匀后静置2mi

5、n，检测样品。2.5.3SDS-PAGE凝胶电泳①安装玻璃板②加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌10%分离胶时，用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度。小心在分离胶上覆盖一层水，以隔绝空气。③当水和凝胶之间出现一条清晰的线条时，说明凝胶已聚合。倒去水并用吸水纸将水吸干。④加入TEMED后立即摇匀灌胶。将剩余空间灌满4%浓缩胶，立即将梳子插入浓缩胶中。如有气泡，拔除梳子重新灌制。室温垂直静置，等待聚合。⑤用水冲洗浓缩胶，将其放入电泳槽中。⑥加入已煮沸变性的蛋白样品，上样量一致。⑦在电泳槽中加入1×电泳缓冲液。电泳时间4～5h，电压为40V。电泳至溴酚蓝刚

6、跑出终止电泳，进行转膜。2.5.4转膜①切取6张大小一样的滤纸，其大小与转印区域一样。然后，把它们浸泡在电转缓冲液中。切取同样大小的一张PVDF膜，轻轻置于有超纯水的平皿里浸2h。②在PVDF膜上垫3张滤纸，然后将凝胶平铺于PVDF膜上，再放上3张滤纸，用玻棒在滤纸面上滚动除去各层气泡，然后放入电转仪内，用60V转移2h。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。③转完后将膜用1×丽春红染液染5min。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。2.5.5免疫反应①将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。②倾去封闭液，

7、加入用TBST稀释至适当浓度(在1.5ml离心管中)的一抗;室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min;再用TBS洗一次，10min。③同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min;再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。2.5.6化学发光，显影，定影①将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触;1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。②