创伤性脑损伤神经细胞凋亡及其相关基因Bcl2及Fas表达的实验性研究

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1、华中科技大学硕士学位论文创伤性脑损伤神经细胞凋亡及其相关基因Bcl-2及Fas表达的实验性研究姓名：宋旭东申请学位级别：硕士专业：法医病理学指导教师：秦启生2003.5.1t铀伤性髓损伤神经细匏摘亡及其相关基西壁盟—壁宴堕垂连煎堡墼焦壁塞!塞担壅创伤性脑损伤神经细胞凋亡及其相关基因Bcl-2及Fas表达的实验性研究华中科技土学同济医学院敞医学系研究生宋旭东导师春启生摘要f神经细胞凋亡在创伤性脑损伤中的重要病理生理学意义已受L到神经病理学及法医病理学的高度重视哥为了进一步阐明细胞凋／亡在创伤性脑损伤中的作用与地位，

2、探讨凋亡相关基因Bcl．2(B—celllympoma／leukemia-2)和Fas在脑挫伤后神经细胞凋亡中的调控机制，同时评价创伤性脑损伤后神经细胞Bel．2和Fas蛋白表达与早期脑损伤时间推断的应用价值，本课题对中度大鼠脑挫伤模型进行更深入地研究。本课题选用成年Wistar大鼠，采用改进的Edward自由落体撞击仪复制中度脑挫伤模型，通过常规苏木素．伊红染色技术(hematoxylinandeosin，HE)对大鼠中度脑挫伤后12小时内继发性脑损伤的病理学改变、神经细胞凋亡的时序空间分布特征进行光镜观察，同

3、时运用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白过氧化酶连接法(StreptavidinPeroxidaseConjunctionMethod，SP)，并结合计算机图象分析技术对凋亡相关基因Bcl一2及Fas蛋白表达变化的规律与脑损伤时间的关系进行定量分析。／‘／实验组用自由落体撞击法形成大脑右顶叶中度脑挫伤后，按l不同的预定时间段(30min、lh、2h、4h、6h、8h、1卟和12h，每个时间段大鼠6只)分批处死动物并立即取出全脑置于4％多聚甲醛溶液(4℃)中固定；假性损伤组经0．4％戊巴比妥钠(用量为：华中辩技_天学商

4、济医学院法医学系硬士研究生毕娩论文辣I页共60页t勘伤性脑损伤神经细瞻猕亡及其相关基西B照壁基堕整鲤塞篷焦塑窭!塞趁壅lml／kg)麻醉后仅行开颅手术而不行落体撞击，并于术后30min处死、取脑；死后损伤组于处死后1h行落体撞击。各组标本均在脑挫伤灶中心旁开2mm冠状切除挫伤灶前后端的脑组织，标本经取材制片后作Bcl一2、Fas免疫组化染色观察，同时行HE染色对照。免疫组化染色观察结果通过计算机图象分析技术行细胞平均光度值定量测定，然后用社会科学统计软件包10．0．7版(statisticalpackagefor

5、thesocialscience，SPSS)对所得数据进行单因素分组对比分析。实验结果显示：中度脑挫伤后30分钟在脑挫伤周围即可出现Bcl．2弱阳性表达的神经细胞：1小时后阳性细胞数量增多，染色程度加深，伤后4小时染色程度达高峰，且阳性细胞分布广泛，不仅在脑挫伤灶周围，在远离挫伤灶的部位如：同侧海马、齿状回、侧脑室周围、甚至对侧脑实质内也可见到。损伤4小时后阳性细胞染色强度又骤然降低，至伤后lO．12小时阳性细胞的着色程度与伤后1小时对比无显著差异(P>O．05)。正常对照组、死后损伤组Bcl一2表现为阴性反应，

6、假性损伤组在骨窗对应处周边脑组织内可见极少量的Bcl一2弱阳性反应，但与损伤组对比存在显著差异(P

7、应。常规HE病理切片观察中度脑挫伤后在损伤灶的中心即可出现华中科技大学同济医学院法医学系硕士研究生毕韭论文第2页共帕页《剑伤牲踮损伤掸经细糖嗣亡及其相关基因Bcl一；壁塑垂鲨壁塞墼丝煎塞!塞塑壅神经细胞坏死、组织碎裂、出血等病变。随存活时间延长，挫伤中心灶及其周边出现不同程度的组织水肿、胶质细胞反应性增生及炎性细胞浸润等传统的病理学改变，此外，在挫伤灶周边及远离挫伤灶的脑组织中还出现少量散在分布的凋亡神经细胞。凋亡细胞出现比细胞坏死晚，主要分布在海马、齿状回及侧脑室周围脑组织，但凋亡神经细胞的数量仅占Fas阳性反

8、应细胞中的极少部分。V实验结果表明：创伤性脑损后存在神经细胞坏死和凋亡两种方式，其中凋亡是迟发性神经细胞死亡的主要形式。脑挫伤可以快速激活凋亡相关基因Bcl．2与Fas的表达，促使其参与神经细胞凋亡的调控，但神经细胞是否发生凋亡则取决于促凋亡与抑凋亡基因之间复杂的调控机制。脑损伤后Bcl．2与Fas蛋白表达呈现一定的时相规律性，且实验组与死后损伤对照组间也存在显著差异，因