肺癌Fas表达水平与抗Fas治疗生物学效应关系的研究

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1、肺癌Fas表达水平与抗Fas治疗生物学效应关系的研究作者：李虹郑世营赵军蒋东张晓膺【摘要】目的：研究肺癌细胞表面Fas表达水平与抗Fas治疗生物学效应之间的关系。方法：将低表达Fas的肺癌细胞A-549细胞通过脂质体介导的方法转染Fas基因，并用流式细胞直接免疫荧光术检测Fas的表达；采用鼠抗人Fas单克隆抗体DX-IgG1κ诱导转染Fas基因的和未转染Fas的A-549细胞的细胞凋亡作用,并用碘化丙啶染色流式细胞术检测。结果：转染Fas基因后的A-549细胞Fas分子表达明显增加,Fas分子表达率从26.11%增加到68.69%;鼠抗人Fas单克隆抗体D

2、X-IgG1κ诱导的转Fas基因的A-549细胞凋亡数明显增多,达66.3%,而未转基因的A-549细胞凋亡较少,仅7.4%。结论：人类恶性肿瘤细胞系对Fas抗体触发凋亡信号的敏感性主要依赖于细胞表面Fas的表达水平。【关键词】肺肿瘤；Fas；凋亡[Abstract]Objective：ToinvestigatetherelationshipbetweenexpressionlevelofFasandanti-Fasbiologicalresponsiveness.Methods：Withdirectimmunofluorescenceflowcytome

3、try,expressionofFaswasdetectedinlungcarcinomacell7lineA-549transfectedanduntransfectedwithFasgene.Apoptosiswasinducedwithanti-FasantibodyDX-IgG1κandmeasuredbyflowcytometry.Results：ExpressionofFaswasincreasedsignificantly,positivecellnumberincreasedfrom26.11%to68.69%;Apoptosisinduc

4、edwithanti-FasantibodyDX-IgG1κ(inlungcarcinomacelllineA-549transfectedwithFasgene)reached66.3%,significantlyhighierthanthatinlungcarcinomacelllineA-549untransfected(7.4%).Conclusion：ThesensitivityofhumanmalignantcelltoFas-mediatedapoptosisismainlydependentontheexpressionofFas.[Key

5、words]Lungneoplasms；Fas；ApoptosisFas是近年发现的细胞凋亡信号受体,当与其特异性配体(FasL)结合后,可以传导凋亡信号,诱导Fas所在细胞的凋亡[1]。肿瘤细胞对Fas/FasL系统介导凋亡的敏感程度是由许多因素决定的,涉及到许多调控机制。细胞表面表达有功能的Fas分子并达到一定水平是经由Fas/FasL系统途径进行凋亡作用的重要因素[2]。我们通过对肺癌细胞株A-549转染Fas基因后Fas表达水平增加,观察Fas表达水平对Fas抗体诱导凋亡作用的影响。1材料和方法71.1细胞、培养条件及基因转染方法人肺癌细胞株A-5

6、49由中科院上海细胞所提供。RPMI-1640含有16%FCS，10mmol/LHepes和2mmol/L谷氨酰胺的培养液培养于37℃的CO2孵箱内。培养细胞复苏后在4周内用于实验研究。脂质体介导的转染技术：将对数生长期的A-549肺癌细胞常规消化传代培养，37℃，18～24h后，使细胞达到30%～50%融合；无菌制备A液：经聚乙二醇法纯化的真核表达Fas质粒pCMV-Fas(深圳晶美公司提供)2μg+100μl无血清RP-MI21640；B液:5～20μlLipofectin2000+100μl无血清RPMI-1640；轻混A、B液,室温静置10～15m

7、in；用无血清培养液洗细胞2～3次；将A、B混合液1.8ml无血清培养液轻轻混加到细胞上；孵育6～12h；用含FCS的全培养液换液,继续培养48h；稀释后传代到选择培养基中(G418浓度为800μg/ml)；每5～7天换液1次并密切观察细胞生长状态；14～20天可见有细胞克隆长出，继续培养，待克隆长到较大肉眼可见，直径约1～2mm时，将克隆灶移入96孔板,长满后再移入24孔板,最后在培养瓶中扩增培养,传代建系。1.2流式细胞术检测Fas的表达采用直接免疫荧光法流式细胞术检测细胞表面Fas的表达。FITC标记的小鼠抗人FasIgG1κDX-型抗体购自美国Ph

8、armingen7公司。同时做同型阴性对照反应,用同样浓度的无关小