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1、人参皂苷Rg1对抗脑缺血再灌注大鼠脑组织FAS、FASL蛋白表达的定量分析作者：刘霞包翠芬魏嘉梁佳秦书俭【摘要】目的：探讨人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注大鼠脑组织FAS、FASL表达的影响。方法：取健康雄性SD大鼠30只。将其随机分为假手术组，模型组，人参皂苷Rg110、20、40mg/kg组，阳性药物对照组，每组5只。采用线栓法制作大脑中动脉栓塞模型。于MCAO术后6小时，采用免疫印迹法对CA1区的FAS、FASL蛋白表达情况进行定量检测。结果：模型组大鼠大脑右侧海马CA1区FAS、FASL含量最高;假手术组FAS、FASL含量最低;R
2、g120、40mg/kg组的FAS、FASL蛋白含量显著降低，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，其中Rg140mg/kg组FAS、FASL蛋白含量最低。结论：人参皂苷Rg1防治大鼠脑缺血再灌注损伤的机制可能与抑制脑组织FAS、FASL表达有关，且以高剂量效果较好。【关键词】人参皂苷Rg1;脑缺血再灌注;FAS;FASL;免疫印迹免疫印迹技术(Westernblot)是目前科研中较常用的蛋白定量检测方法之一，该法具有灵敏、高效等特点。本实验拟采用Westernblot法对脑缺血再灌注(cerebralischemia8repe
3、rfusion，CIR)后大鼠海马CA1区神经细胞FAS、FASL的表达进行定量检测，并观察人参皂苷Rg1对FAS、FASL蛋白表达的影响，以明确人参皂苷Rg1是否通过调控FAS、FASL蛋白的表达来抑制CIR损伤后的神经细胞凋亡。 1材料与方法 1.1实验动物及分组 取健康雄性SD大鼠，饲养7天后随机分为6组：①假手术组;②模型组;③Rg110mg/kg组;④Rg120mg/kg组;⑤Rg140mg/kg组;⑥阳性药物对照组;每组5只大鼠。③～⑤组分别于术前5天至取材当日连续腹腔注射人参皂苷Rg1;⑥组注射尼莫地平注射液，①、②组分别注
4、射1.5ml等渗生理盐水，均为1次/d。 1.2主要实验药品 人参皂苷Rg1(纯度>95%)，吉林大学有机化学教研室;尼莫地平注射液，山西亚宝药业，批号071001;兔抗鼠FAS、FASL(Ser63)单克隆抗体，SANTACRUZ公司;Marker预染蛋白质分子量标准、BCA、NBT/BCIP、PMSF，碧云天生物技术研究所;其余试剂由辽宁医学院科学实验中心提供。8 1.3大鼠右侧局灶性脑缺血模型的制备 10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉，模型制作采用改良线栓法[1]。线栓采用头端光滑烫圆的直径0.23mm鱼线，由右侧颈总动
5、脉分叉部缓慢向颈内动脉颅内方向插入约(18.5±0.5)mm，使线头通过大脑中动脉起始处，阻断大脑中动脉的血流;假手术组插入深度<15mm。阻塞后2h，将尼龙线轻轻拔出行再灌注，再灌注时间为22h。 1.4免疫印迹检测及强度分析 MCAO术后24h,取各组大鼠5只，迅速断头取出右侧海马置于液氮冷冻,-80℃冰箱保存。取冷冻脑组织,加入RIPA裂解液,剪碎、超声波粉碎20s后静置30min,4℃,12000r/min离心20min,留取上清液。用二喹啉甲酸法测定蛋白含量,并按照每20μl含50μg蛋白制成样品，-20℃冰箱保存。按实验室常规上
6、样、电泳、转膜后,5%小牛血清白蛋白室温封闭1～2h。加入一抗(兔抗大鼠FAS、FAS-L,稀释度为1∶400)4℃孵育过夜,TBST缓冲液洗脱3次,每次5min;二抗(碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体,稀释度为1∶200)室温孵育1h,TBST缓冲液洗脱3次,每次5min;BCIP/NBT显色;扫描电泳条带,用凝胶分析软件分析电泳条带强度。采用βActin作为内参照。扫描电泳条带,用凝胶分析软件分析各蛋白目的条带的吸光度。根据目的条带与内参照条带吸光度的比值表示待测蛋白含量。8 1.5统计学分析 数据分析应用SPSS10.0软件，所有数据均用
7、±s表示。多组间差异显著性检验采用单因素方差分析。 2结果 免疫印迹结果显示，模型组大鼠大脑右侧海马CA1区FAS、FASL含量最高;假手术组FAS、FASL含量最低;Rg120、40mg/kg组和阳性药物对照组大鼠海马CA1区的FAS、FASL蛋白含量显著降低，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，其中Rg140mg/kg组FAS、FASL蛋白含量最低;Rg110mg/kg组与阳性药物对照组比较有显著性差异(P<0.05)，而Rg120、40mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P>0.05)。见表1，图1
8、。表1各组大鼠MCAO术后24h海马CA1区FAS、FASL蛋白表达含量比较注：与假手术组比较，*P<
