老年人急性白血病MLL基因与免疫表达异常及预后的临床意义

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1、老年人急性白血病MLL基因与免疫表达异常及预后的临床意义作者：赵峻峰王立新张秀珑蔡艳霞房胜春【摘要】目的检测老年人急性白血病患者混合系白血病(MLL)基因表达水平，并对部分患者转录本进行动态检测，以观察治疗后基因表达量的变化，并检测其免疫表达异常率和比较治疗效果及与巢式PCR结果进行敏感度比较。方法利用荧光实时定量PCR(RQPCR)技术检测MLL融合基因，观察白血病MLL基因的表达水平，分析MLL基因重排的发生频率和免疫表型异常的病例，进行化疗。对照MLL基因异常及免疫表达异常的临床意义。结果41例老年白血病中7例检测到MLL基因，发生率为17.07%，

2、其中MLLAF64例(24.5%);其中4例缓解，其MLL基因中位数均低于平均值。免疫表达异常在MLL基因中的检出率较无MLL重排发生频率高，为28.8%，发生率较无MLL基因重排高，且临床缓解率低。基因重排及异常表达与缓解率有关。结论RQPCR监测融合基因表达可以有效观察治疗效果，敏感性高，MLL基因重排与白血病分子机制有关。其次免疫表达异常的患者MLL基因重排检出率相对较高，其临床缓解及疗效差，可能提示预后不良。【关键词】急性白血病;MLL基因;免疫表达异常10　　老年人急性白血病是老年人常见的因造血干/祖细胞于分化过程的不同阶段发生分化阻滞、凋亡障

3、碍和恶性增殖而引起的一组异质性造血系统恶性肿瘤，其往往病情危重，由于年龄因素化学治疗是常见或唯一的治疗方式。混合系白血病(MLL)基因，又称为髓系/淋巴系白血病基因，是一种转录调控因子，参与组成复杂的转录调控蛋白复合物。原发性急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)和继发性白血病都可以出现MLL基因异常，具有MLL基因异常的白血病称为MLL相关白血病。MLL基因重排的致白血病机制目前尚不完全清楚，白血病细胞免疫表型测定是近些年诊断白血病的检查，不同类型白血病细胞其免疫标记物不同，当出现异常表达时，治疗的有效率可能存在差异。本文拟检测老年人急

4、性白血病MLL基因重排的白血病细胞系以探索MLL基因与白血病免疫表达异常及疗效的相互关系，以揭示白血病中复杂而多变的致白血病分子机制，并确定其治疗意义。　　1对象与方法　　1.1对象2005年9月至2010年4月我院血液科确诊初发或复发老年急性白血病41例，其中男19例，女22例，年龄63～89(中位数74)岁;ALL6例，AML35例;初发37例，复发4例。用多重巢式PCR检测白血病相关融合基因及实时定量PCR(RQPCR)分析MLL基因重排的发生频率，检测白血病细胞的免疫表型，总结其免疫异常表达。所有病例均经临床、形态学、免疫学、组织化学染色、细胞遗传

5、学确诊。10　　1.2方法　　1.2.1标本采集对41例老年人白血病的骨髓标本的MLL基因表达水平进行了检测，其中原始细胞百分比大于70%的29例，小于70%的12例;将患者分为MLL基因组及无MLL基因组。同时流式细胞仪检测白血病细胞的免疫表型。进一步分析MLL基因重排的类型、免疫表达异常及疗效的关系，并进行化疗。化疗方案为AML为HAA(阿克拉霉素20mg/d、1～4d，阿糖胞苷0.2/d、1～7d，高三尖杉酯碱5mg/d、1～7d)或DEA(阿糖胞苷0.2/d、1～7d，柔红霉素40～60mg/d、1～3d，依托泊苷0.1/d、1～7d);ALL采用V

6、AP(长春新碱2mg、d1，泼尼松40～60mg/d、1～7d，阿糖胞苷0.2/d、1～7d，)、VDP(长春新碱2mg、d1，柔红霉素40～60mg/d、1～3d，泼尼松40～60mg/d、1～7d，)等经典治疗方案，比较其缓解率。　　1.2.2MLL基因表达水平的检测制备质粒检测质粒及测序：采用常规TA载体克隆方案，将上述方法所得的融合基因克隆片段装入T载体中，并转染大肠杆菌菌株，经LB平板筛选，含氨苄西林80U/ml培养基培养后抽提、纯化重组质粒-20℃10备用。对质粒行PCR反应，行电泳(同上)及测序确证质粒含有目的片段。质粒标准品的定量与稀释：运

7、用紫外分光光度仪(UV2100型)对抽提的质粒进行定量测定，并根据公式计算其拷贝数以注射用蒸馏水连续10倍稀释定量的质粒，选择浓度范围为103～108拷贝/μl。　　1.2.3MLL融合基因表达水平检测骨髓经淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞，采用RNA纯化试剂盒(Gentra公司)提取总RNA，经紫外分光光度计测定A260nm/A280nm值。用Primer3引物设计软件设计MLL、MLLAF9和GAPDH引物，所用cDNA序列为MLL(NM_005933)、AF9(NM_004529.1)和GAPDH(BC025925)。根据用SyBrGreenⅠ进行R

8、TPCR的要求，为取得较高的扩增效率，PCR产物片