海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术

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1、海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得——或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：j运晦签字日期：砷07年6月7日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。

2、本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：戈彰导师签字；力往签字日期：卅年6月7日签字日期：_1年6月7日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术利用基因芯片高通量、平行性的特点，选择针对各弧菌的16SrRNA、hsp60和2至6个不等的毒力相关基因，设计了由29个探针组成的寡核苷酸芯片和28对基因特异性引物。利用国际生物技术信息中心网站(http：／／www．n

3、cbi．nlm．nih．gov／)进行每个基因序列的BLAST搜索和相关文献的检索，检索到各基因的同源序列后，再将各基因与其同源序列用omiga软件进行比对，找出保守区和特异区，分别处理保存后导入AllcldD3．0软件或ArrayDesigner4．0软件，设计扩增产物片段长度为200—500bp的引物和长度为45·55bp的探针。将设计好的探针再全部导入omiga软件进行比对，确定探针之间最多不超过四个连续碱基相同，而且位置刚好处于引物扩增区，然后交由基因公司合成。将合成后的探针按照设定的位置分布用手动点样仪点在尼龙膜上，经紫外交联后固定在膜上组成寡

4、核苷酸膜芯片。用酚一氯仿抽提法提取细菌总DNA作为PCR的模板，然后用基因特异性引物加入地高辛标记的dUTP扩增并标记各菌株的待测目的片段，标记后的PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检查后测定标记产量，然后配制成20ng／ml的杂交液同时与膜芯片进行杂交，对杂交时间、PCR产物浓度设计梯度试验以优化反应条件，检测芯片的灵敏度。杂交结束后的反应信号用NBT-BCIP液显色后进行分析。试验结果显示其中12个毒力相关基因均能特异性显色，无其它交叉反应，可以作为菌株是否含有该毒力基因的检测方法，作为菌株是否致病的重要参考指标，而每种弧菌的16SrRNA和hsp60

5、探针点(共10个)则都会与其它一至三种弧菌的16SrRNA、hsp60发生交叉反应(溶藻胶的hsp60除外)，其反应信号不能作为菌种准确鉴定的依据，只能作为菌株是否是弧菌的鉴定依据。试验中溶藻胶弧菌的omp、副溶血弧菌的自m、费氏弧菌的ampC在PCR反应中能很好的扩增出单一的目的条带，但在杂交信号中没有出现显色反应。试验中费氏弧菌的omp和enf,灿烂弧菌的ael'v和vsm未能扩增出目的条带，因这些基因有菌株特异性，说明试验菌株不是具有该基因的菌株。芯片检测灵敏度可达到2．56ng目的基因，相当于12．8pg细菌DNA。结果证明本试验中的膜芯片在结合

6、16SrRNA、hsp60和毒力基因共同组成的图谱中，能够准确鉴别出鳗弧菌、哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌和费氏弧菌等六种弧菌，以及样品是否含有试验所涉及2海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术的毒力基因。关键词：弧菌毒力基因PGR地高辛杂交膜芯片拮抗检测海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术DevelopmentofmembranechiptechnologyaboutidentificationandvirulencegenesdetectionofmarinefishvibriosABS’IRACTVibriosisi

7、sfishdiseaseresponsibleforconsiderableeconomichardshiptomaricultureoperationsworldwide．Bothpathogenicandnon-pathogenicstrainsexistinthemarine矗妣detectionofthevi_rulellcegeneswiHhelpindifferentiationofpathogenicstrains．Conventionalmicrobiologicalmethodsidentifyingtheseorganismsa∞of

8、tenlimitedbythelengthoftimerequiredtocom