CRF及其受体在豚鼠胃肠道神经系统的表达及功能的研究

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1、中山大学博士学位论文CRF及其受体在豚鼠胃肠道神经系统的表达及功能的研究姓名：高翔申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：胡品津2003.5.16中山大学学位论文中文摘要CRF及其受体在豚鼠胃肠道神经系统的表达及功能的研究博士研究生：高翔导师：胡品津教授摘要研究背景和目的肠易激综合征(irretablebowelsyndrom,IBS)是最常见的一种功触性肠道疾病，大量的实验和临床资料证实，精神应激及对应激的情绪应答与IBS的发病和恶化密切相关。fIBS症状中与排便相关的器官包括分泌腺体、肌肉以及控制、整合它们整体活

2、动的神经系统。胃肠道的神经支配由交感神经、剐交感神经和肠道神经系统共同组成。而肠道神经系统(entericnervoussystem，ENS)是由肠肌层神经丛和黏膜下神经丛共同形成的独立于中枢神经系统的完整的神经体系。应激相关因子促皮质激素释放因子(Corticotropin-releasingfactor，CRF)通过作用于它的两个受体亚型CRF．(Corticotropin—releasingfactortypelreceptor)和CRF2(corticotropin-releasingfactortype2r

3、eceptor)在应激应答中发挥多种多样的生理和病理作用，特别是对胃肠遵动力和分泌功能的影响，如胃排空延迟、结肠传输运动加速以及引起水样腹泻。研究表明不但中枢注射CRF可诱发与应激的病理生理应答中相同的胃肠道功能改变，外周静脉内或腹腔内注射CRF亦可引起与中枢相同的胃肠功能反应。CRF不能通过血脑屏障，而且外周给予CRF受体拮抗剂虽不能阻断中枢的CRF的作用却可阻断外周的CRF效应．说明外周的CRF通过作用于外周的受体发挥作用。既往的研究发现CRF及其受体在中枢和一些外周器官有表达，但在胃肠道神经系统中有无CRF及其

4、受体的表达和分布，以及它们在胃肠道神经系统的作用国内外目前均未见报道。在胃肠道，P物质(substanceP，SP)是由胆碱能运动神经元合成的小分子神经激肽，通过神经激肽受体l(neurokioireceptorl，NKI)等受体支配消化道的效应系统，在黏膜可引起水和电解质的分泌增加．导致水样腹泻。研究发现应中山大学学位论文中文摘要激可导致sP的释放，而且释放量的多少与刺激的频率和强度有关。动物实验中sP和选择性NKI受体激动剂SP6．II可显著增加蒙古沙鼠粪块的排出，NKI受体选择性拮抗削TAK-637则可显著抑制

5、脑室内注射CRF、限制性应激、SP6-11诱发的排粪，提示应激应答中CRF与SP，NKl系统间存在相互作用。新近的研究发现，CRF通过CRFl受体激活结肠肠肌层的胆碱能神经元诱发实验大鼠近端结肠动力改变和水样腹泻。目前尚不知这种改变与肠道神经系统中胆碱能神经元合成的SP的活性是否有关。基于以上的分析，本研究运用免疫荧光组织化学单染色和双标记染色、RT-PCR、ECLWestern-blot等方法研究CIlF及其受体在胃肠道神经系统的表达、表达CRF及其受体的神经元的细胞形态和分布、与其他神经化学标志物的共存情况；细胞

6、内微电极记录技术及神经生物素示踪的方法探讨CRF对胃肠道神经系统的电生理作用、对CRF产生效应的神经元的形态、所表达的受体亚型；组织培养和RIA法研究CRF与胃肠遒神经系统中SP的关系，从而较为系统地对CRF及其受体在胃肠道神经系统中的表达和生理作用进行探索，为更深一步研究应激在IBS发病机制中的作用提供实验基础。Y，、区蠡。第一部分CRF在豚鼠胃肠道神经系统的表达一1．免疫荧光组织化学单染色和双标记染色＼截取30只成年雄性Hartley-Dawley豚鼠的小肠／结肠组织，置于含平滑肌7胍秘剂尼卡地平(1JlM)的K

7、reb’s液中冰浴。沿肠系膜边缘剪开肠腔，清除肠腔内容物。展平组织，黏膜面向上．固定标本于底层铺有Syigard的35cmPetri平皿上。室温下组织固定液中浸泡3hr，取出后用PBS液反复冲洗。解音g显微镜下轻柔刮除黏膜层并逐层分离黏膜下层、环行肌层，取得黏膜下神经丛和肠肌层神经丛整层组织。进行血管活性肠肽、P物质、生长抑素等的免疫组化染色时，需显微分离新鲜标本，40pM秋水仙碱浸泡处理，并在细胞培养箱中孵育4．．-6hr后再固定和染色。分离的黏膜下神经丛，肠肌层神经丛组织置于含10％普通驴血清的PBS液中孵育lh

8、r后加入第一抗体(实验所用抗体见“材料”)，对照组加入第一抗体和Ⅱ中山大学学位论文中文摘要相应的阻断肽，室温下孵育18hr；双标记染色时两种不同的第一抗体可同时加入，一起染色。标本取出后PBS液反复冲洗。加入FITC或cy3标恚的第二抗体，室温下孵育1hr，冲洗后甘油封片。带滤光器的荧光显微镜观察，SPOTRT冷光源数码相机摄像，SPOTⅢ软件