实验七、转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测

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1、实验七、转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测原理GUS基因就是转β-葡糖醛酸酶基因，它存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。根据地gus基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高），其中最为常用的是组织化学法。•组织化学法检测：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作为反应底物。将被

2、检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞被转入了GUS基因，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。本实验材料中使用的转基因载体的部分图谱克隆拟南芥中的AK12基因的启动子插入到PBI101载体GUS基因的上游的克隆位点（具体图示如下）农杆菌转化转化拟南芥AK12-proRB35S-proNPTПNOS-terGUSN

3、OS-terLBpBI101本实验基本流程拟南芥AK12-pro种子萌发，长成幼苗取幼苗组织化学检测--GUS检测报告基因GUS的表达的检测材料：拟南芥AK12-pro试剂：GUS工作液：在450mlddH2O中加入82mg铁氰化钾，105.6mg亚铁氰化钾，50ml1mol/L50ml1mol/L磷酸钾缓冲液（pH70pH7.0），加水至500ml，4℃储存备用。1mol/LGUS染色液：用DMSO溶解100mgX-Gluc，再加入GUS工作液，定容至100ml，分装成小管，置于-20℃储存备用。组织化学染色检测--GUS染色1.取2支1.5ml离心管，各加入0.5ml

4、1mol/LGUS染色液；2.用镊子夹取转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心管中；3.37℃浸泡过夜（或2-5h）；（晚上6：30继续下面的脱色和照相步骤）4.倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；换一次75%乙醇脱色；肉眼或在解剖镜下观察染色情况；拍照。如果有GUS基因表达产物，则出现蓝色。实验报告完成四次实验报告第5周：DNA浓度和纯度检测、PCR产物和质粒的凝胶电泳检测（实验报告1）第6周：质粒DNA的酶切及凝胶电泳检测DNA片段的连接及凝胶电泳检测（实验报告2）第7周：大肠杆菌感受态细胞的制备与转化（实验报告3）第8、9周：Gus染色（实验报告4）