GUS基因的定性和定量检测

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1、1．GUS报告基因的定性检测GUS能与显色底物X-gluc 反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性研究GUS的表达水平和表达模式。GUS 染色的稳定性好，组织定位精确，成为在植物中运用很广的报道基因。1.1GUS染色底物的配制按下表1配制GUS染色的底物。表1.GUS染色底物的配制试剂名称母液浓度母液配制方法工作液浓度工作液配制方法磷酸缓冲液（pH7.2）0.5M将0.5MNa2HPO4 和0.5MNaH2PO4 混合*50mM1ml TritonX-10010%取10mlTritonX-100溶于水，定容至100ml。0.1%0.1ml铁

2、氰化钾K3Fe(CN)6100mM将3.2924g铁氰化钾溶于水，定容至100ml。2mM0.2ml亚铁氰化钾K4[Fe(CN)6] ·3H2O100mM 将4.2239g亚铁氰化钾溶于水，定容至100ml。2mM0.2mlEDTA0.5M 将18.61gNa2EDTA·2H20溶于水，调pH为8.0，定容至100ml水。10mM0.2mlX-Gluc/ 2mM10.4mgddH2O// 定容至10ml*0.5MNa2HPO4配制方法：将17.907gNa2HPO4溶于水，定容至100ml。0.5MNaH2PO4的配制方法：将7.800gNaH2

3、PO4溶于水，定容至100ml。 1.2 染色步骤1)   染色：加入适量配制好的GUS 染液于24孔板的孔中，将待测样品浸到GUS染液中，将24孔板置于37℃保温箱中放置6h。2)   漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。3)   脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。4)   记录：在体视显微镜下拍照记录。2．GUS报导基因的定量检测GUS 能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量1

4、98.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。MU的激发波长为365nm，发射波长为456nm，其含量可由荧光分光光度计测出。因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。2.1 试剂配制1)   1mol/LNa2HPO4溶液：35.814gNa2HPO4溶于100ml水。2)   1mol/LNaH2PO4 溶液：15.601gNaH2PO4 溶于100ml水。3)   0.1M 磷酸缓冲液(PH7.0)：1mol/LNa2HPO4取5.77ml，1mol/LNaH2P

5、O4取4.23ml，定容至100ml。4)   10％ SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10gSDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。5)   0.5MEDTA(PH8.0)：在80ml水中加入18.61gNa2EDTA•2H2O，用NaOH调PH至8.0（约需2g左右的固体NaOH），溶解后定容至100ml。6)   GUS酶提取液：0.1M 磷酸缓冲液（PH7.0）取50ml；10%SDS取1ml； 0.5MEDTA(PH8.0)取2ml；TritonX-100取100ul；β-巯基乙醇100ul；用水

6、定容至100ml。7)   MUG底物：称8.8mgMUG，溶于10mlGUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。8)   反应终止液（0.2mol/LNa2CO3 ）：称2.12Na2CO3 ，用水定容到100ml。9)   考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G25010mg,95%乙醇5m1,H3PO4 10ml，定容至l00ml，过滤后4℃保存。10) １mg/mlBSA：20mgBSA，用GUS提取缓冲液定容至20ml。2.2 植物总蛋白的提取1)   取新鲜的植物组织100mg左右，用液氮将生物材料急速冷冻，然后采用液氮研磨的方

7、式在研钵里磨碎组织。如果不立即研磨，可以先将液氮冷冻处理的植物组织储存于-80℃冰箱。2)   将研磨破碎的组织转到Ep管里，并立即加入1ml的GUS提取缓冲液，充分混匀。3)   12,000rpm,4℃离心5min，将上清转至另一洁净的Ep管，冰上放置待用。2.3 蛋白浓度的测定（Bradford法）1)   取7个Ep管，分别加入0μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl的BSA标准液，用水补至相同体积20μl。加入980μl的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。以

8、蛋白浓度（mg/ml）对吸收值A595做标准曲线。2)   取待测蛋白样品10μl，加10μl水，加入980μl的考马斯亮蓝G250溶液