FGF在卵巢癌中的表达及其信号传导途径

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1、中国医科大学博士学位论文FGF在卵巢癌中的表达及其信号传导途径姓名：张颐申请学位级别：博士专业：细胞生物学指导教师：孙黎光2003.3.1FGF在卵巢癌中的表达及其信号传导途径中文摘要目的卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，其死亡率高居妇科恶性肿瘤之首。近年研究发现，成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，FGF)是一种强有力的细胞分裂促进因子，对成纤维细胞在内的多种细胞具有促进增殖和分化的功能，与肿瘤生长密切相关。FGF主要包括酸性FGF(aFGF)和碱性FGF(bFGF)。已

2、发现FGF在肾细胞癌、膀胱上皮癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中均有过度表达，在卵巢癌中也发现存在高表达的bFGF及其受体，但在原发性卵巢癌中，尚未见有关aFGF与其发生发展关系的报道。本文采用RT--PCR技术和westernblot方法，对40例上皮性卵巢癌组织中aFGF、bFGF及其受体FGFR．的表达进行了研究。迄今为止，有关FGF在卵巢癌中的信号传导机制尚不清楚。本研究观察了aFGF和bFGF对卵巢癌细胞系CAOV3细胞增殖的促进作用及对细胞内蛋白激酶c(PKC)和细胞外信号调节激

3、酶(ERK)活性的影响，并观察了ERK激酶MEK，抑制剂PD98059处理后PKC及ERK的变化趋势及对细胞增殖的影响，揭示FGF诱导卵巢癌细胞增殖的信号传导机制，并为通过阻断信号传导途径治疗卵巢癌提供实验依据。材料与方法1．RT--PCR法检测上皮性卵巢癌组织中aFGF、bFGF和FGFR，的表达；westernblot方法检测上皮性卵巢癌组织中bFGF和FGFR。的表达。2．细胞计数实验和Mrrll比色法观察aFGF、bFGF和PD98059对卵巢癌细胞系CAOV3细胞增殖的影响。3．倒置相差显微镜、扫

4、描电镜、透射电镜、Hoechst33258荧光染色观察PD98059处理后CAOV3细胞形态学的变化。4．DNA梯度电泳、流式细胞术、TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)观察PD98059处理后CAOV3细胞的凋亡情况。5．以；卞同浓度的aFGF、bFGF和PD98059诱导CAOV3细胞，利用[1一”P]ATt’掺入外源性底物的方法，液体闪烁测定PKC及ERK活性的变化。实验结果1．aFGF、bFGF和FGFR，在上皮性卵巢癌中的表达：RT—PCR及westernblot结果提示aFGF、b

5、FGF、FGFR，在卵巢癌及交界性肿瘤中均有过度表达，与正常卵巢、卵巢瘤样病变及卵巢良性肿瘤相比，差异有显著性；而在正常卵巢、卵巢瘤样病变及卵巢良性肿瘤中，以上三项指标则无显著差异。Ⅲ～Ⅳ期与I～Ⅱ期及交界性肿瘤比较，aFGF、bFGF、FGFR。表达水平均有显著升高(P<0．05)；而I～Ⅱ期及交界性肿瘤之间则无显著性差异。在FIGO分期相同的条件下，aFGF与bFGF、aFGF与FG—FR。及bFGF与FGFR。均具有相关性(P<0．05)。以上三项指标在高、中、低分化卵巢癌中无显著差异，与肿瘤病理类型

6、无关。2．细胞计数法和MTY比色法结果均显示，随aFGF浓度升高，CAOV3细胞增殖比明显增加，且与aFGF浓度成剂量依赖关系(P<0．05)；随bF—GF浓度升高，CAOV3细胞增殖比亦明显增加，bFGF浓度为75ng／ml时活性最强；加入PD98059后，CAOV3细胞增殖比明显下降，其下降程度随PD98059浓度增加而增加，PD98059对aFGF和bFGF诱导的细胞增殖的抑制作用更明显。3．PD98059处理后，倒置相差显微镜下可见细胞密度明显降低，细胞间隙增宽，细胞缩小变圆，固缩成多个小亮点，高倍

7、镜下见细胞内颗粒增多并可见空泡状改变。扫描电镜下见细胞体积明显缩小变圆，细胞表面微绒毛消失。透射电镜下可见细胞表面微绒毛显著减少，核内染色质聚集成块，边集，沿核膜内侧分布，核膜褶皱内陷，胞浆空泡样变。Hoechst33258荧光染·2·色见核内出现浓染、致密的颗粒状荧光的凋亡细胞。4．PD98059处理后的CAOV3细胞DNA电泳可见清晰的阶梯状DNA条带，流式细胞仪分析见G，期前出现凋亡峰。TUNEL实验显示细胞核内出现棕褐色颗粒，提示为凋亡细胞。5．aFGF、bFGF诱导后CAOV3细胞PKC及ERK活

8、性变化：随aFGF及bFGF浓度增高，PKC及ERK活性均明显升高，当bFGF浓度为75ng／ml时，PKC和ERK活性达到峰值。6．PD98059诱导后CAOV3细胞PKC及ERK活性变化：加入抑制剂PD98059后，PKC及ERK活性均明显受抑制(P<0．05)。其抑制程度与PD98059浓度呈剂量依赖关系。PD98059对aFGF(或bFGF)诱导的细胞PKC及ERK活性的抑制作用更明显(P<0．05)。讨