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1、第32卷分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告第8期2004年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1086～1089碱性二苯基萘基甲烷染料褪色光度法测定透明质酸钠1,23111陈莲惠 刘绍璞 罗红群 胡小莉1(西南师范大学化学化工学院,重庆400715)2(川北医学院化学教研室,南充637007)摘 要 在弱酸性介质中,碱性二苯基萘基甲烷染料与透明质酸钠作用形成结合产物时将导致溶液光吸收发生变化,在585～616nm附近褪色且吸光度差(ΔA)值与透明质酸钠浓度成正比,在0.1～2.5mg/L(维多利亚蓝B)、0.5～2.0
2、mg/L(夜蓝)和0.1～0.6mg/L(维多利亚蓝4R)范围内符合Beer定律,表观摩尔吸光系88-1-15数达1.51×10～5.52×10L·mol·cm(透明质酸钠的分子量以5×10计),其中,维多利亚蓝4R灵敏度最高。据此,建立了一种新的测定透明质酸钠的分光光度法。该法简便、快速,灵敏度高,选择性好。应用于润舒氯霉素滴眼液、润洁滴眼露和施沛特注射液中透明质酸钠的测定,结果满意。关键词 透明质酸钠,褪色光度法,碱性二苯基萘基甲烷染料1 引 言透明质酸(Hyaluronicacid,简称HA),又名玻璃酸,是由(1→3)222乙酰氨基222脱氧2β2葡萄糖醛
3、酸双56糖重复单位所组成的直链多聚糖,HA分子量随分子链的长度不同而不同,一般为2×10～7×10。它广泛存在于动物的各种组织介质中,具有很强的粘弹性,溶解度较差,使用时常将它转化为钠盐(sodium1,23～95hyaluranate,简称SH)。目前已被广泛应用于化妆品和临床治疗、诊断(如眼科手术、治疗关678,9节疾病、修复软组织、预防术后粘连以及作为药物载体等),因此在化妆品行业、药学和医学中1011(尤其在眼科中)非常重要。目前常用的测定方法有生化法和免疫法(放射免疫法(RiA)、酶联免疫法(ELISA)和免疫荧光法)。基于SH与碱性二苯基萘基甲烷染料结合
4、产生的褪色反应,利用分光光度法测定SH,方法简单,体系稳定,结果准确。碱性二苯基萘基甲烷染料(如维多利亚蓝B,VBB;夜蓝,NB;维多利亚蓝4R,VB4R)是一类具有大共轭体系的碱性染料,在弱酸性环境中,与由于SH的酸性基团的离解而成为带多个负电荷的大阴离子发生缔合作用使溶液明显褪色,在最大褪色波长处,ΔA(A0-A)值与SH浓度成正比。方法具有高灵8-1-1敏度,摩尔吸光系数达到10L·mol·cm数量级,据此建立了一种测定SH的新的褪色光度法。本实验研究了离子缔合物的吸收光谱特征,适宜的反应条件以及共存物质的影响,用于滴眼液和注射液中SH的测定,结果满意。2 实
5、验部分2.1 仪器与试剂UV28500紫外2可见分光光度计(天美公司);PHS23C酸度计(上海大中分析仪器厂);721A分光光度计(四川仪器九厂)。夜蓝(中国医药上海化学试剂站);维多利亚蓝B(中国医药上海化学试剂站);维多利亚蓝4R(CHROMA)水溶液:0.01%;透明质酸钠(SIGMA公司)标准溶液:配制1.0000g/L的储备液,冰箱保存,使用时稀释到10.0mg/L;HAc2NaAc缓冲溶液。所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。2.2 实验方法于10mL比色管中依次准确加入适量SH标准溶液、HAc2NaAc缓冲溶液和0.01%的染料溶液(NB210
6、mL、VBB1.5mL或VB4R3.0mL),以二次去离子水定容,摇匀。以对应的试剂空白作参比,用1cm比色皿在各体系最大褪色波长处测定吸光度,其中试剂空白记为A0,含有SH的记为A,计算ΔA=A0-2003207201收稿;2004203224接受本文系重庆市科委资助项目(No.200227472)和四川省教育厅青年科学基金资助项目(No.2003B013)第8期陈莲惠等:碱性二苯基萘基甲烷染料褪色光度法测定透明质酸钠1087A。3 结果与讨论3.1 吸收光谱以灵敏度最高的VB4R为例,按照实验方法得到吸收光谱和与SH反应的差示光谱,分别如图1和图2所示。由图可知
7、,在pH2.1的HAc2NaAc缓冲溶液中,以水作参比时,染料溶液的最大吸收波长在585nm处,当它与SH反应生成缔合产物时,在585nm处产生明显褪色,与此同时,在528和676nm附近出现了新的吸收峰(以试剂空白作参比),但灵敏度较低、规律性差。NB和VBB与HA作用与VB4R相同,灵敏度稍差。3.2 反应条件的选择3.2.1 酸度的影响 实验了溶液pH值对吸光度的影响,结果如图3。由图可见在pH2.8～6.0(NB)、2.6～4.0(VBB)和1.8～3.0(VB4R)的HAc2NaAc缓冲溶液中,缔合产物比较稳定,ΔA值较大;缓冲溶液的适宜用量为0.5～
