利用微梁表面应力研究界面吸附蛋白的构象变化过程

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1、http://www.paper.edu.cn利用微梁表面应力研究界面吸附蛋白的构象变化1过程李凯，张青川，伍小平中国科学技术大学，中科院材料力学行为和设计重点实验室，合肥（230027）E-mail：zhangqc@ustc.edu.cn摘要：本文提出了一种基于微悬臂梁表面应力的传感来研究蛋白质分子构象变化的新方法。通过分子自组装的方法将蛋白质分子——溶菌酶修饰到微悬臂梁的单侧金膜表面上，并将微梁置于磷酸缓冲液（PBS）中。用激光三角法检测改变溶液时微梁的形变。实验结果显示：当用6M盐酸呱置换PBS缓冲液时，微梁的表面应力发生了变化致使微梁发生弯曲变

2、形，这对应着溶菌酶分子从紧凑的小球状构象转变为无规的松散线团状构象。当再用PBS缓冲液置换盐酸呱变性剂，观察到微梁朝反方向发生形变，与之前的过程对比可知，此过程对应着溶菌酶分子构象的回复——从无规的松散线团转变为紧凑的小球。这种方法的特点在于它提取的是界面吸附蛋白质分子构象变化过程中分子间相互作用力的信息。这为我们深入认识界面吸附蛋白质的构象变化机理提供了一种新的视角。关键词：构象转变；溶菌酶；表面应力；微悬臂梁；蛋白复性中图分类号：O63；O341．引言[1-2]随着人类基因组测序的完成，弄清作为基因表达产物的蛋白质的结构和功能就成为当前生命科学中最

3、为重要的问题。蛋白质由20种氨基酸以肽键连接而成，这种肽链在空间卷曲折叠成为特定的三维空间结构——即蛋白质的构象，随所处环境的不同蛋白质在空间中能表现出不同构象——即蛋白质构象的折叠。蛋白质的功能只有在正确的构象下才能得以实现，[3-4]老年痴呆症、疯牛病等疾病的病因就是由于人体内有关蛋白质的构象错误而引起的。作为研究蛋白质构象的一个重要方面，吸附界面上蛋白质的构象问题一直为人们所关注：例如[5]人造器官，人造组织引入人体后与人体的相容性问题、细胞膜上的一些蛋白质通过改变其[6]构象来控制离子通道的开合问题以及其它一些问题都与此密切相关。这一问题的复杂

4、性在于其中既涉及动力学的过程：蛋白质在界面上吸附过程，又涉及热力学的过程：蛋白质最终所达到的平衡态构象，以及这种构象随环境变化时所伴随的响应（构象折叠）。而且，这两个过程也有着关联性，如在吸附的过程中也必然伴随构象的变化。围绕着这些问题，人们[7-11]运用各种方法已进行了大量的研究，如SPR，QCM、椭圆偏光法等。但由于实验方法本身的限制，目前的研究给出的大多是有关吸附过程的吸附速率，和吸附完成后最终的吸附量信息，有关吸附过程中构象的变化以及这种构象如何随外部环境的改变而变化的研究还很少见到报道。微悬臂梁传感是在原子力显微镜（AFM）和微机电系统（M

5、EMS）出现后迅速发展起来[12]的一种新的传感方法，其在生化传感中有着很好的应用前景。研究发现：当微梁的表面[13]上有生化反应发生时，微梁的表面应力会发生改变并导致微梁产生弯曲变形。R.Berger[14]等人用此方法观察了镀Au微梁表面硫醇分子的自组装生长过程。R.McKendry等人将它应用于DNA双链的配对杂交实验。本实验室近年来从事微梁传感技术的研究工作：在微梁阵[15-16]列的非制冷型红外成像方面已取得了室温物体成像的结果。最近，我们提出利用微梁表1本课题得到国家教育部博士点基金（20040358027）的资助。-1-http://ww

6、w.paper.edu.cn面应力的传感方法研究大分子的构象转变问题，并对结构比较简单的人工合成大分子：聚[17]N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）随温度变化时的构象转变过程进行了研究。本文尝试将这种方法应用到界面吸附蛋白质分子的构象折叠问题上来。文中所选用的蛋白质分子是溶菌酶（图1），它是一种小的单体球蛋白,由129个氨基酸残基组成。主要存在于动植物的组织液和某些微生物体内，具有杀菌作用，不仅具有重要的应用价值同时也可作为研究蛋白质构象[18-21]变化的良好模型。这些研究指出：自由溶液中溶菌酶分子，受到外界环境的影响时，比如改变其周围溶液的性质，其

7、构象可在紧凑的小球状构象和无归的线团状构象之间转变，并且具有很好的变复性（构象转变的可逆性）。这些构象的转变是通过荧光光谱的方法检测溶菌酶蛋白在自由溶液中构象转变后荧光基团的形成或改变等而得到确认。本文提出用微梁传感的方法对界面吸附的溶菌酶分子的构象变化性质进行研究。图1溶菌酶分子结构示意图图2实验系统示意图（取自美国RCSBProteinDataBank）Fig.2Schematicoftheexperimentalset-upFig.1MoleculerstructureofLysozyme2．实验系统与原理实验系统如图2所示。长200um×宽20

8、um×厚1um的SiNx微悬臂梁（见图2中插入的微梁放大图）固定于玻璃盖封顶的不锈钢的小容器中