D二聚体单克隆抗体制备及其在免疫荧光快速定量检测中的应用

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1、224中国医药生物技术2012年6月第7卷第3期ChinMedBiotechnol,June2012,Vol.7,No.3DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.013·技术与方法·D-二聚体单克隆抗体制备及其在免疫荧光快速定量检测中的应用康可人，吴培钿，卢艳华，张健，唐时幸，王继华D-二聚体（D-dimer，D-D）是纤维蛋白单体经活化因箱为美国Thermo公司产品；SDS-PAGE电泳仪购自北京子XIII作用后形成的交联纤维蛋白凝块，再经纤溶酶水解六一公司；飞测

2、免疫荧光定量检测仪由广州万孚生物技术有所产生的一种特异性降解产物，医学应用上将它作为一个特限公司研制；高速冷冻离心机为日本Hitachi公司产品；[1]异性的纤溶过程标记物，反映纤维蛋白溶解功能。与纤维ACLTOP血凝分析仪为美国Beckman公司仪器，D-D检蛋白破坏有关的疾病，如深静脉血栓形成（DVT）、肺栓塞测试剂为西班牙WerfenGroup产品。（PE）和弥漫性血管内凝血（DIC）等，均可导致体内D-D1.1.3临床样品来源自2011年1月至6月期间，收[2-6]水平升高。近年来D-D的临床应用范围

3、越来越广，除集江门市五邑中医院门诊病人血浆（枸橼酸钠抗凝血，离心了以上提及的疾病外，在恶性肿瘤、糖尿病、肝脏疾病、脓收集血浆），共106例。D-二聚体含量均经血凝仪定值。毒血症的诊断以及溶栓治疗监测方面均具有重要的参考价1.2方法[7-9]值。1.2.1杂交瘤细胞株的建立取6~8周龄的BALB/c目前D-D蛋白检测方法主要有胶体金法、酶联免疫吸小鼠，首次免疫将福氏完全佐剂与等体积的D-D蛋白乳化[10]附法（ELISA）和第二代胶乳凝集法（免疫比浊法）。胶后于小鼠皮下、足垫处注射，50μg/只，经3次加强免疫

4、后，体金法快速简单，但无法实现定量检测；ELISA法可精确尾静脉采血，间接ELISA法检测小鼠血清效价，效价大于4定量，但操作步骤繁琐；免疫比浊法敏感性高，检测结果准10的小鼠，腹腔冲击免疫1次，3d后取其脾细胞制备杂[11]确，但试剂以进口为主。荧光免疫定量检测技术，属于即交瘤。细胞融合按照常规半固体法进行。将离心好的融合细[12]时检测（point-of-caretesting，POCT）领域的新兴技术，胞，依次加入FBS、饲养细胞、HAT溶液、半固体培养基，能快速、灵敏、简便地实现指标的定量检测，免疫荧

5、光定量定容至40ml，置于混匀仪上混匀30min后，分别倒入检测技术经过一定阶段的发展，目前主要在感染性指标（如30个培养皿中，确保半固体均匀贴皿底，装入湿盒，37℃，C反应蛋白）和心脏标志物指标的应用上较为多见，厂家5%CO2培养箱中培养。5~7d后，挑选大小适中的单集以欧美、韩为主。本研究利用杂交瘤技术制备筛选能稳定分落克隆，转入96孔板培养，细胞长至培养孔面积50%后，泌特异性抗D-D抗体的细胞株，初步应用于免疫荧光定量用间接法检测细胞上清，筛选高效价的细胞株进行多次亚克检测平台，实现对D-D快速定量检

6、测，为临床相关疾病的隆，确保细胞株在体外连续传代3个月和多次冻存后再复诊断、治疗、监测提供有效工具与手段。苏仍能稳定分泌抗体。经定株后常规制备腹水，采用小鼠体内诱生法制备腹水，经正辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，1材料与方法制备单克隆抗体。1.1材料1.2.2单克隆抗体的鉴定1.1.1试剂及动物人源D-二聚体蛋白购自英国Abcam1.2.2.1效价测定单克隆抗体的效价采用间接ELISA公司；纤维蛋白原购自北京博润莱特科技公司；人纤溶酶、法测定。用D-二聚体蛋白（1μg/ml）包被ELISA板，将弗氏完全佐剂（

7、FCA）、弗氏不完全佐剂（FIA）、小鼠单克抗体稀释到1mg/ml后，从1:1000浓度开始做10倍稀隆抗体亚型检测试剂盒均购自美国Sigma公司；RPMI1640释，加入板中，37℃孵育1h，洗涤后加二抗HRP标记培养基、胎牛血清（FBS）、HAT、HT、聚乙二醇（PEG）的羊抗鼠-IgG反应，洗涤后加入TMB底物显色，设阴性（Mw4000）均为美国Gibco公司产品；羊抗鼠IgG-HRP（N）、阳性（P）对照。效价以P/N>2.1为阳性标准。酶购自北京中杉金桥公司；纤维蛋白原降解物（纤维蛋白解1.2.2.

8、2Ig类和亚类的鉴定采用小鼠mAb分型试剂复合物、D和E片段）由本室制备保存；小鼠骨髓瘤细胞盒测定抗D-D单抗的Ig亚类。依照试剂盒说明书操作。系（SP2/0）为本实验室传代保存；实验室用水为超纯水；所用化学试剂均为国产分析纯。SPF级BALB/c纯系小鼠，基金项目：“重大新药创制”科技重大专项（2011ZX09506-001）鼠龄6~8周，体重18~22g，由中山大学实验动物中心作者单位：5106