甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育差异表达基因及雄配子发育研究

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1、华中农业大学博士学位论文甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育差异表达基因及雄配子发育研究姓名：吴建勇申请学位级别：博士专业：作物遗传育种指导教师：杨光圣20061101甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育差异表达基因研究及雄配子发育研究3．利用SSH构建了正向(可育材料作为“Tester”，即富集了可育材料中上调表达的基因)和反向(不育材料作为“Tester”，即富集了不育材料中上调表达的基因)两个文库，每个文库中包含3072个克隆，经扩增，纯化后每个文库都得到了单带且条带较亮的克隆2000多个(正向文库2081，反向文库2293)，片段大小平均在500bp

2、左右。4．将上述每个文库中经纯化后的2000多个克隆，外参(九DNA扩增片段)，内参(actin，fl-mbulin和BNACBP)以及阴性对照(人类TFR和pUCl9)在大连Takara公司点制成eDNAmieroarray，其中纯化后的克隆在每张芯片上重复点两次，每个对照重复点48次，芯片的杂交和分析工作按照正常的操作流程进行，最终在正向文库中筛选得到1369个上调表达的克隆，而反向文库中仅有12个上调表达的克隆(比值≥2)。通过点杂交去除重复克隆后。最终对其中400个克隆进行了测序，Blast分析表明它们归属于216个unigenes(

3、212个在可育材料中上调表达，4个在不育材料中上调表达)。生物信息学分析发现可育材料中上调表达的212个基因中，178个可以在NCBI找到同源序列。根据其参与的生物学过程，它们可以划分为17个组(不包括未分类的蛋白)，其中参与代谢，细胞防御，细胞组分的生物合成以和蛋白命运的占的比例最大，分别占11．11％，7．69％，6．55％和5．70％。在正向文库中，从所测序列中选取9个进行Northern杂交验证，结果有8个与芯片结果一致，这说明了芯片结果的可信性；反向文库的4个序列中有1个结果与芯片结果一致。5．细胞学观察发现，Rsl046AB的不育

4、株在减数分裂过程的初期，所有细胞都呈细胞核浓缩状态，表明它们已经开始降解。虽然在相当于正常植株的四分体时期，有31％的细胞能够脱离浓缩状态而继续发育，但是在染色体状态为粗线期时，所有细胞又停止其发育，这一过程中，有部分细胞的染色体出现随机分裂，有些细胞则可以观察到核质桥和微核的出现。即使当“拟小孢子”(mierospore·sanalogue)出现时，这些细胞核浓缩的细胞和脱离浓缩状态的不正常细胞也能被观察到。而这些都表明不育材料中的染色体变得很不稳定。因此，结合差异表达的筛选结果，我们推测，造成这种现象的原因可能是由于DNA错误信息的存在导

5、致减数分裂过程中的一些检测点(eheckpoint)被激活，而不育植株中由于DNA损伤修复不能正常进行，因而不能完成减数分裂过程。本研究对通过eDNA芯片筛选到的参与DNA修复的3个ESTs进行了RT-PCR的研究，结果显示这3Ⅱ华中农业大学博士学位论文2006个ESTs在两材料间的表达存在明显差异：1个在不育材料中不表达，2个在不育材料中表达量剧减，而且这三个基因都只在花蕾中表达。6．利用KEGGOrthology(KO)-BasedAnnotationSystem0COBAS)软件对正向文库中的差异表达序列进行了分析，结果212个序列中有

6、41个(19．34％)被分配到47个KO本体中，通过分析，共得到9个可能与雄配子发育相关的途径，其中氮素代谢，硝基苯降解和淀粉、蔗糖代谢三条途径可能在雄配子发育过程中有着重要作用(P

7、它们的表达模式很不一致。QuantityOne@软件的定量分析表明，在可育材料中大部分ESTs集中在1-3mm左右的花蕾中表达；而在不育材料中，各个时期除了能观察到部分基因的表达被完全抑制外，还有部分基因的表达时间出现了滞后现象，这说明不育材料中不仅基因的表达量有所改变，而且其表达时间也有所影响。空间表达的RT-PCR结果表明，有6个ESTs是花药特异表达的，有6个ESTs的表达具有组织偏向性，其中5个偏向于在花蕾中表达，还有3个ESTs在各个组织中表达量相似。关键词：甘蓝型油菜；显性核不育：mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)；cDNA

8、-AFLP；抑制消减杂交(SsH)；KOBAS；雄配子发育，RT-PCRIll甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育差异表达基因研究及雄配子发育研究AbstractRapes