河北省不同地区粮食赭曲霉毒素A污染情况及OA致细胞损伤作用的研究

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1、河北医科大学博士学位论文河北省不同地区粮食赭曲霉毒素A污染情况及OA致细胞损伤作用的研究姓名：李增宁申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：张祥宏20070401英文缩写中文摘要河北省不同地区粮食赭曲霉毒素A污染情况及OA致细胞损伤作用的研究摘要赭曲霉毒素(Ochratoxins，OT)是由赭曲菌(Asperegillusalutacells)和纯绿青霉(Penicilliumviridicatum)产生的有毒代谢产物，包括七种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OA)为主，毒性也最大。OA的分子量为404，熔点169℃，为无色晶体，

2、易溶于有机溶剂(三氯甲烷和甲醇)和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水。在紫外线照射下OA呈绿色荧光，最大吸收峰为333nm。该化合物相当稳定，一般的烹调和加工方法只有部分破坏。动物实验表明。赭曲霉毒素A具有肾毒性、免疫毒性和致癌、致畸、致突变性。1993年国际癌症研究中心将赭曲霉毒素A列为可能的人类致癌物。一些国家已报道了从人全血、血清及人奶中检出赭曲霉毒素A。研究表明，粮食污染是人类赭曲霉毒素A暴露的主要途径。研究分析粮食赭曲霉毒素A污染情况对保障食品卫生和安全具有非常重要的意义。目前，国外文献中已有不少粮食赭曲霉毒素A污染情况的分析检测报道，不少国家和国际组织还根据赭曲霉毒素A

3、的污染情况制定了人体赭曲霉毒素A摄入量的限制标准。迄今为止，国内有关粮食中赭曲霉毒素A的污染情况报道较少。目前，有关粮谷中赭曲霉毒素A的检测方法主要有薄层色谱法(TCL)、酶免疫检测法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)等。我国谷物和大豆中赭曲霉毒素A的国家标准检测方法是TCL法，属于目测半定量法，最低检出量为10pg／kg，不适用于粮谷中赭曲霉毒素A的准确测定和居民赭曲霉毒素A的膳食摄入量的暴露评估研究。为准确分析我国粮食中OA的污染情况，进一步探讨OA污染的生物学意义，本研究对OA的检测方法进行了改进，建立了灵敏度高、重现性好、准确可靠的OA高效液相色谱荧光定量

4、检测方法。对河北省不同地理环境的三个地区粮食中赭曲霉毒素A污染情况进行了定量检测。同时，以细胞培养、FCM等方法研究了OA对人外周血单个核细胞增殖和凋亡的影响，探讨了OA对人正常’肾小管上皮细胞株(HKC)和人肺泡II型中文摘要上皮细胞(AT-II)细胞系A549凋亡的诱导作用。在上述工作的基础上，采用WesternBlotting和免疫组化方法等方法在蛋白水平上对JNK通路在OA诱导细胞损伤中作用及OA诱导细胞损伤的机制进行了研究。本研究共分为五部分第一部分赭韭霉毒素A检测方法的建立目的：建立SPE．C18柱纯化和富集一高效液相色谱法荧光检测粮谷和酒类样品中赭曲霉毒素A

5、的系列方法。方法：l用三氯甲烷提取玉米、小麦和大麦样品中的OA后，经C18固相萃取柱净化处理，以乙腈：水：乙酸(99：99：2)作为流动相，用带有荧光检测器的反相高效液相色谱法(激发波长为333nm，发射波长为460nm)检测OA含量；2选用C18固相萃取小柱(250mg／3m1)，用2ml乙腈和2ml水分别活化C18小柱，30ml酒样通过C18固相萃取小柱，控制流速30滴／分。再用2ml乙腈溶液洗脱，最后将C18小柱抽干。45℃下氮气吹干，流动相溶液稀释至0．5ml，0．45p．m微孔滤膜过滤后取20止进高效液相色谱仪进行检测。结果：1．分别在小麦和大麦样品中加入3种不

6、同量的OA标准物。小麦加标样品的回收率为78．60％～92．73％，变异系数为1．460／一2．98％，大麦加标样品的回收率为77．610／一93．21％，变异系数为1．740／一3．45％；为考察该方法的准确度，对北京中检维康玉米加标盲样(OA浓度范围介于5．33～9．91ng／g)进行了检测，结果为6．75ng／g，在盲样范围内，经f检验，在95％的置信水平上，测定平均值(n=3)与盲样给定值无显著性差异。2．本实验对干红葡萄酒，白葡萄酒和红葡萄酒分别进行了0．25ng／ml、O．5ng／ml、1．5n∥ml三个浓度的加标回收，对三种葡萄酒样品，每个加标水平平行3份，

7、按上述方法提取测定，各种样品的加标回收率均在80．1～109．8％。平行三次测定加标回收率的相对标准偏差在1．5-5．2％之间。第二部分河北省不同地区粮食中赭曲霉毒素A污染情况研究目的：分析河北省不同地理环境地区居民食用粮食OA污染情况，了解河北省居民OA的暴露量，揭示其对健康的可能影响，为减少OA污染及其影响奠定基础。方法：抽样检测河北省不同地理环境的三个代表性地区粮食OA污染情况，三个地区分别为河北省南部邯郸市磁县、河北省中部石家庄市赞皇中文摘要县和河北省北部塞外地区张家口市赤城县。分别入户采取中南部地区居民日常食用主粮小