2013临床PCR检测技术_实习生讲课

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1、临床PCR技术KaryB.MullisUSA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method1930年提出了两种核酸DNA和RNA的概念1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构及其半保留复制模型。一、PCR概述一、PCR概述（一）PCR概念PCR（polymerasechainreaction)是一种在体外通过重复DNA合成，以扩增特定核苷酸序列的方法。特点高灵敏度高特异性体外进行快捷PCR的概念核心技术是从水栖高温菌中分离到能耐高温的Taq酶，使扩增反应不需要每一个循环加一次DNA聚合酶，

2、从而实现了自动化。应用领域迅速扩大，PCR技术成为了分子生物学中的一项突破性技术。PCR概述——2000至2013年发表论文1280748篇一、PCR概述（二）原理双链DNA变性退火链延伸（膜板）（双链分成单链）（膜板与引物杂交）（DNA合成）不断重复二、实验步骤（一）核酸提取1.DNA提取100ul浓缩液100ul血清吹打混匀12000g离心5min弃上清20ul提取液100℃煮10min模板二、实验步骤2.RNA提取10ulA液200ulB液震荡混匀8000g离心1min200ulDEPC乙醇65℃干燥10minRNA模板8000g离心1min逆转录为cDNA弃上清

3、重复洗2次50ul血清3、细胞或组织剧烈震荡400ul试剂1加入400ul试剂2震荡混匀12000g离心5min完全弃上清加入试剂3模板加样扩增杂交显色（二）扩增HBV引物(168bp)：上游：5-GAAGTGTGACGTTGACATCC下游：5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGG扩增体系：（50μl体系）10*Buffer---5μldNTP---1μlMgCl2---3μlPrimerF---2μlPrimerR---2μlDNA---2μlTaq酶---1μlH2O---34μl反应程序预变性94C3min循环延伸72C5min。注：每组实验阴性对照用无

4、菌生理盐水代替模板58C45s72C45s94C45s30循环（三）结果判读（四）PCR的常见问题及处理措施常见问题污染：表现为阴性对照同样出现目的条带或阴性对照出现‘S’形曲线。污染的来源：来自其他测试样品的DNA来自试验材料如重组克隆的DNA外源DNA污染来自同一靶序列前一次PCR的扩增产物。（三）PCR的常见问题及处理措施如何减少污染实验室分区酶法控制尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG)短于100bp的PCR产物不能用UNG完全消除污染。紫外线表面照射消除试剂、加样头中的DNA污染。对短PCR产物效果不好以预防污染为主良好的实验室操作三、荧光定量PCR（一）荧光P

5、CR定量的概念以外参已知数量拷贝数的标准品为标准，通过扩增及对荧光值的监测，对PCR起始模板量的定量。（二）荧光定量PCR原理染料染色SYBR®GreenI溴乙锭(EthidiumBromide)探针标记TaqManTM分子信标(Molecularbeacons)TaqMan探针reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.Polymeris

6、ationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'（三）定量PCR的数学原理PCR理论方程N=N0x(1+E)nN:扩增数量N0:起始模板数量E：扩增效率n:循环数指数期PCR定量方程才有效Log[DNA]循环数线性增长期Linear平台期Plateauy=x(1+e)n指数增长期GeometricPCR曲线线性图谱半对数图谱起点定量与终点定量起点定量终点定量“加进不同拷贝的膜板”半对数图谱线性图谱同一个样品重复96次起点定量的优势终点产物数量：误差太大拐点产物数量：重现性好起始DNA量，更具意义重现性好，误差小起点定量的关键：CT值CT值：荧

7、光信号有统计学意义显著增长(穿过阈值线)时的循环次数CT值半对数图谱CT值线性图谱CT起始DNA浓度当循环次数n=CT值时：RT=RB+X0(1+E)CTRslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs即CT=-klgX0+b（线性方程）Rn=RB+X0(1+E)nRsCT值-X0作图CTX0CT=-klogX0+b四、PCR检测的临床应用（一）标本采集要求项目标本采集HBV无菌注射器抽取2毫升静脉血或其它体液注入无菌试管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或体液标本